第3章-真菌生物学检验基本技术课件

第3章真菌生物学检验基本技术第一节概述真菌（Fungus）具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁）细胞壁含几丁质和（或）纤维素无根、茎、叶，不含叶绿素以腐生或寄生方式摄取养料能进行有性生殖和（或）无性繁殖对人类致病的真菌分为：

浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，顽固性，但影响身体较小；

深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。此外，有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起中毒性真菌病。一、生物学性状细胞壁为几丁质(Chitin)（多聚N－乙酰葡萄糖组成），并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。细胞内有较为典型的核结构和细胞器。（一）形态结构真菌多糖的分布真菌多糖主要分布于真菌的菌丝、子实体及其发酵液中。在不同的部位含量有所不同，在真菌的菌丝体的细胞壁和细胞质中存在较多，其他地方较少。真菌多糖主要是在菌丝体细胞壁和细胞质中提取。真菌的形态①单细胞真菌呈圆形或椭圆形。以出芽方式繁殖。主要为酵母菌和类酵母菌，如隐球菌、念珠菌。②多细胞真菌由菌丝和孢子组成。菌丝分枝交织成团，形成菌丝体（Mycelium），并长有各种孢子。通常称之为丝状菌或霉菌（Mold）。二相性真菌（dimorphicfungus）：孢子与菌丝可随生存环境（营养、温度、氧气等）的变化发生互变，如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。多细胞真菌的形态构成菌丝营养菌丝（伸入到培养基内）气生菌丝→生殖菌丝（露出于培养基表面）孢子有性孢子由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融合形成绝大多数属于非致病性真菌所具有无性孢子分生孢子分生孢子梗的顶端或侧面大分生孢子小孢子菌属、表皮癣菌属小分生孢子毛癣菌属叶状孢子菌丝细胞直接形成芽生孢子隐球菌、念珠菌关节孢子球孢子菌、毛孢子属厚膜孢子新型隐球菌子囊孢子菌丝末端形成膨大的囊状结构即孢子囊，内含很多孢子根霉菌鹿角状菌丝菌丝梳状菌丝螺旋状菌丝结节状菌丝球拍状菌丝大分生孢子小分生孢子孢子厚膜孢子芽生孢子孢子囊孢子大分生孢子分生孢子梗顶囊真菌孢子和细菌芽胞的区别真菌孢子细菌芽胞抵抗力不强。60-70℃短时间杀死强。煮沸短时间不死数目一条菌丝可产生多个孢子一个细菌体只形成一个芽孢作用为繁殖方式之一不是繁殖方式形成位置可在细胞内外形成只在细菌细胞内形成形状形态、色泽多样圆形或椭圆形（二）培养特性大多数真菌营养要求不高，常用沙保氏培养基（SDA）培养。浅部病原性真菌最适培养温度为22-28℃，生长缓慢，多于1-4周出现典型菌落。深部病原性真菌最适培养温度为37℃，生长较快，经3-4天即长出菌落。真菌菌落类型类型定义特征颜色举例酵母型菌落为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖光滑、湿润，一般为乳白色新型隐珠菌类酵母型菌落外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，由伸长的芽生孢子形成光滑、湿润，一般为乳白色白色念珠菌丝状菌落为多细胞真菌的菌落，由许多管状、分枝菌丝体组成绒毛状、絮状、粉末状、颗粒状、石膏状。可产生各种色素。毛癣菌（三）变异性真菌易发生变异，在人工培养基中多次传代或孵育过久，可出现形态结构、菌落性状、色素及毒力等改变。（四）抵抗力真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂有一定的耐受力，但充分暴露于阳光，紫外线及干燥情况下大多数真菌可被杀死，且对2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。对热敏感，一般60℃1小时可杀死真菌菌丝和孢子。二、致病性与免疫性1.真菌性感染：主要是外源性感染浅部真菌侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。深部真菌侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。（一）致病性2.条件致病性真菌感染：主要是内源性感染（如白色念珠菌），亦有外源性感染（如曲霉菌）。条件：慢性消耗性疾病。糖尿病、白血病、长期应用化疗、皮质类固醇激素的患者。免疫力低下，菌群失调。3．过敏性真菌病：由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反应性肺泡炎和癣菌疹等。4．真菌毒素中毒症：侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。（二）免疫性1．非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。2．特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键，T细胞分泌的淋巴因子、以T细胞为主导的迟发型变态反应引起免疫病理损伤能局限和消灭真菌，以终止感染。三、微生物学诊断常见标本的类别①各种分泌物，包括泌尿生殖道分泌物、耳垢、痰及其他；②皮肤的角质性物质如毛发、指（趾）甲、鳞屑及其他；③脓汁及渗出物；④血液及体液，体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等；⑤粪便和尿液；⑥活组织标本；⑦环境中各种标本材料。（一）

直接检查1．不染色标本的直接镜检：直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。

1）标本制备：

2）检查方法：

3）封固液：①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）。③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。注意事项①采取部位要恰当。深部真菌感染可采取脓汁、痰液、血液、脑脊液等。浅部真菌感染，应刮取病变部位边缘的痂、鳞屑。发癣应取折断的病发等。②标本应新鲜。特别是深部真菌标本，尽量在取材后立即检查，最长不得超过两小时，如不能立即送检则必须放入冰箱中保存，尽速送检。③应在用药前采集标本。如已用药则需停一段时间药后再采集标本。④标本的采集量要充足。血液和脑脊液不得少于5ml，胸腔液不得少于20ml。活体组织要采取两份，一份送病理科检查，一份送镜检和培养。⑤避免污染杂菌。必须进行严格的无菌操作，必要时在培养基内加入抗生素类。2．染色标本检查：⑴革兰氏染色：各种真菌均为革兰氏阳性，为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。⑵乳酸酚棉蓝染色⑶糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。⑷嗜银染色（GMS）：染成黑色。⑸粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。⑹荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。菌

种荧光反应菌

种荧光反应白色假丝酵母菌黄绿色曲菌绿色新生隐球菌红色鼻孢子菌红色组织胞浆菌红黄色球孢子菌黄绿色皮炎芽生菌黄绿色常见深部真菌的荧光反应（二）培养检查用于确定菌种，辅助直接检查的不足；通常用沙保氏培养基(Sabouraud,含1％蛋白胨、4％葡萄糖或麦芽糖、2％琼脂)（SDA）,22-28℃；深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养。小培养法：小培养法是采用真菌培养板或普通载玻片进行真菌培养。培养物可直接于显微镜下检查，也可经染色后观察。（三）免疫学试验用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特异的诊断。

乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原

ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原四、防治原则真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生；碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效；制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服对癣症和白色念珠菌病等有较好疗效；近年报道5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗单细胞真菌感染疗效显著；二性霉素B可用于深部全身真菌感染。第二节浅部真菌主要为丝状菌，多侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称皮肤癣菌(Dermatophytes)。分为三属，共37个种。一、生物学特征皮肤癣菌的特征属名种数侵犯部位形态特征皮肤指甲毛发大分生孢子小分生孢子菌丝毛癣菌属21+++细长、棒形、壁薄，少见或无梨形、棒形，较多见螺旋状、鹿角状、结节状、球拍状、破梳状，单纯细菌丝小孢子癣菌属15+-+纺锤形，壁较厚，较多见棒形，卵圆形，较少见球拍状及破梳状菌丝表皮癣菌属1++－梨形、壁较薄，多见无单纯菌丝角层癣菌枇糠状鳞斑癣菌可引起汗斑皮肤癣菌

含毛癣菌、表皮癣菌和小孢子癣菌三个属，主要侵犯角化的表皮、毛发和指（趾）甲，引起皮肤癣病，包括手足癣、体癣、灰指甲、头癣等。二、检验方法直接采取病变部位的标本，用显微镜检查有无菌丝及孢子的存在，本法迅速简便，是临床真菌检查最常用的方法。（一）直接镜检皮下组织感染真菌包括着色真菌和申克孢子丝菌。着色真菌可引起着色真菌病、肢体橡皮肿等；申克孢子丝菌可引起孢子丝菌下疳,也可引起深部感染。取毛发、皮屑、甲屑等标本，用70％乙醇消毒，接种沙保氏琼脂斜面培养基，25℃，7-14天。根据菌落形态及颜色、并挑取菌落镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。（二）分离培养本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出不同色泽的荧光，如黄癣菌病发呈暗绿色荧光，白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。（三）荧光检查第三节深部感染真菌深部真菌是侵犯皮下组织和内脏，引起全身性感染的真菌。多数能引起慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死等病变①致病性真菌正常人体内部不存在，一旦侵入机体，即可致病，如组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等。属外源性感染致病菌；②条件致病性真菌是人体正常菌群的成员，当机体抵抗力和免疫力下降时可致病，如新型隐球菌、白色念珠菌、曲霉菌和毛霉菌等。深部感染真菌分类一、白色念珠菌白色念珠菌（canidiaAlbicans）又称白色假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病。为条件致病性真菌。（一）生物学特性卵圆形，大小2μm×4μm，革兰氏染色阳性。有假菌丝。培养特性：典型类酵母型菌落，表面光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母气味。涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。（二）致病性和免疫性可侵犯人体多处部位，可引起：①皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处；②粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。③内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等。机体可产生一定免疫力。白假丝酵母菌在免疫力低下、菌群失调等情况下念珠菌可引起皮肤黏膜、内脏、中枢神经等各个部位的感染，称为念珠菌病如鹅口疮、呼吸道炎症等。革兰氏阳性，圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖；培养特性，普通培养基生长良好，酵母型菌落。（三）检验方法及鉴定1．直接镜检：革兰氏染色镜检。2．培养特点：典型的酵母菌落。3．鉴定试验：①芽管试验；②TZC试验；③糖发酵和糖同化试验；④动物实验；⑤厚膜孢子形成试验。4．血清学诊断：以念珠菌为抗原测定机体抗念珠菌抗体，用于诊断全身性念珠菌病。⑴芽管试验：取少许待检的白色念珠菌接种于0.5ml人或兔血清中，混匀，直37℃水浴2-3h后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。⑵TZC试验：将菌接种于含0.005％氯化三苯基四氮唑的沙保培养基中，经22-25℃，24-48h培养。白色念珠菌不变色或仅为淡红色，其他念珠菌或酵母菌呈红色或深红色。⑶糖发酵和糖同化试验：根据这两种试验可将常见的几种念珠菌进行鉴别。糖同化试验：①将1%的各类糖浸入直径6-10mm的4号新华滤纸片。②将纸片干燥后放-20℃备用。③制备无营养成份的固体琼脂平板（9-12cm）。④将0.5浊度待检菌均匀涂布于以上平板上，贴上不同的以上含糖纸片。35℃，24-48h。⑤若某糖纸片四周有明显的细菌生长，则为此糖同化试验阳性。⑷动物实验：本菌对兔有致病力。兔耳静脉注射本菌，经4-5天死亡。解剖可见肾、肝肿胀、充血，并有小脓肿，涂片及培养均可见本菌及其假菌丝存在。⑸厚膜孢子形成试验：本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯－80琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚膜孢子及假菌丝。二、新型隐球菌又名溶组织酵母菌，是土壤，鸽类，牛乳、水果等的腐生菌，也可存在人口腔中。可侵犯人和动物，一般为外源性感染，但也可能为内源性感染，对人类而言，它通常是条件致病菌。（一）生物学特性较大球形，直径可达5-20um，有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，难以发现，称隐球菌，用墨汁阴性显影法镜检，可见到透明荚膜包裹着菌细胞，菌细胞常有出芽，但不生成假菌丝。在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上，于25及37℃皆可生长，而非病原性隐球菌在37℃不能繁殖。酵母型菌落，呈白色。本菌能分解尿素，以此与酵母菌和念珠菌鉴别。（二）致病性本菌多由呼吸道转入，在肺部引起轻度炎症，或隐性传染。可侵犯中枢神经系统，发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等。还可侵入骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤粘膜引起慢性炎症和脓肿。新生隐球菌大量存在于干燥的鸽粪中，通过呼吸道感染人类，引起隐球菌病。菌体外有肥厚的