半夏外植体诱导综述

半夏外植体诱导影响因素综述Xxxx(XXXXX生命科学学院，杭州下沙，310018)摘要：半夏［PinelliaternateBriet］叶片、叶柄为外植体，用不同的方法接种于含有各种不同激素含量、微量元素含量的培养基中，进行诱导培养。对各种影响因素长生的实验结果进行分析比较。从而了解半夏外植体诱导的最佳环境。主要研究不同植物生长素(2,4-D、IAA、NAA)，细胞分裂素(6-BA，KT)，微量元素(Mn、Fe、Zn)，以及不同的接种方式，不同年龄的外植体植株，对半夏外植体诱导产生的影响。关键字：半夏植物组培外植体诱导MS培养基植物激素Abstract：Theexplantsthatpinellia’sleaves,petioles,usingdifferentmethodsseededinmediumcontainingvarioushormonecontentoftraceelementcontentsintheinducedculture.Wereanalyzedandcomparedtotheexperimentalresultsofvariousfactorsaffectingthelongevity.TounderstandtheofPinelliaexplantsinducedthebestenvironment.Mainlystudythetypeofauxin(2,4-D,IAA,NAA)andcytokinin(6-BA,KT),traceelements(Mn,Fe,Zn),aswellasthetypeofinoculationmethods,ofdifferentagesexplantspLANTS,Pinelliaexplantsinduced.Keywords:PinelliaPlanttissuecultureExplantsMSmediumPhytohormone半夏(PinelliaternateBriet)是天南星科半夏属多年生草本植物，以块茎入药［1］，具有润燥化痰、降逆止呕、消痞散结之功，为常用大宗中药材。半夏多为野生，由于药用和出口量大，加上大量的采挖和山区开发，使得野生资源日趋枯竭而难以满足目前的需求。随着灾害性气候的影响，加之人工栽培过程中多年沿用块茎和株芽无性繁殖的方法，植株感染病毒严重，产量质量下降，致使半夏的栽培生产受到较大的限制，造成半夏的贮量越来越少，而国内外对半夏的需求有增无减，市场价格逐年攀升⑵。近年来，学者们对半夏的生物学特性、化学成分、炮制方法、药用功效、引种驯化栽培技术、组织培养技术等方面进行了广泛的研究，尤其在植物生长调节剂对半夏组织培养和植株再生快速繁苗方面做了大量研究［3-4］。还有少量对半夏组培快繁中微量元素的影响研究⑸。生长素对半夏外植体诱导的影响以MS培养基为基本培养基，单独使用不同浓度的2,4-D、IAA、NAA三种生长素进行诱导培养，对外植体诱导的不同影响。2,4-D的诱导效应实验证明，不同浓度2,4-D对半夏外植体的诱导效应不同。较低浓度的2,4-D有利于小块茎及根的诱导，如某实验⑹，当2,4-D浓度为0.2mg/L时，叶柄、叶片小块茎的诱导率分别为100%和89.4%；当2,4-D浓度为0.5mg/L时，叶柄、叶片根的诱导率分别为80.6%和88.9%。较高浓度的2,4-D有利于愈伤组织的诱导，当浓度为1.0mg/L时诱导出淡黄色疏松愈伤组织，叶柄、叶片诱导率分别为93.3%和63.6%.当2,4-D浓度升高到2.0mg/L时，愈伤组织再分化形成粗短并带有绒毛。IAA的诱导效应IA对半夏块茎的诱导率较高，大部分块茎外植体先脱分化成白色带突起状的胚性愈伤组织，突起的上端逐渐变绿长成小块茎，并产生细长根。比较适合用于半夏的无性快繁，浓度0.5/L的效果较好，小块茎诱导率为67.6%。高浓度的IAA较有利于根的诱导和愈伤组织的形成，抑制块茎的分化⑺。NAA的诱导效应NAA可促进块茎和根的大量形成，当浓度0.2m/L时，叶片、叶柄的小块茎诱导率分别为94.5%和96.0%,根的诱导率分别为90.9%和96.0%。随着NAA浓度的增高，小块茎和根的诱导率逐渐降低，而愈伤组织诱导率升高。当NAA浓度为2.0m/L时，叶片和叶柄的愈伤组织诱导率分别为91.0%和36.0%。说明低浓度的NAA利于根的分化和苗的形成。1.4小结低浓度的生长素均有利于小块茎的产生和根的形成。当214-D、IAA、NAA浓度为0.2mg/L时，均有大量小块茎产生,不同生长素诱导的小块茎产生的植株的形态不同。2,4-诱导时，根数量较少，被绒毛；IAA诱导时，根数目较少，生长较慢；NAA诱导时，根细长，数量多，且叶柄粗壮。分裂素对半夏外植体诱导的影响以MS培养基为基本培养基，单独使用不同浓度的6-BA,KT,ZT三种分裂素进行诱导培养，对外植体诱导的不同影响。6-BA的诱导效应较低浓度6-BA有利于小块茎的诱导。当6-BA浓度为0.2-0.5mg/L时，叶柄、叶片小块茎诱导率分别94.1%-100%和96.0%-100%，当浓度为1.0mg/L时，叶柄的小块茎诱导率为73.3%；随着浓度的升高，在叶片边缘和叶柄的两端产生生绿色的愈伤组织，且生长分化缓慢。当浓度为2.0mg/L时，叶片愈伤组织的诱导率为70.0%。KT的诱导效应当KT浓度为0.2mg/L时，叶柄和叶片的小块茎诱导率分别为80.7%和35.3%,生根率分别为75.0%和9.8%，说明较低浓度的KT有利于叶柄进行植株再生。当浓度增高时，叶柄产生愈伤组织，当浓度为2.0mg/L时，叶柄和叶片的小块茎诱导率生根率分别83.0%和58.0%、62.3%和32.0%，叶柄愈伤组织的诱导率为50.9%，叶片未见愈伤组织产生。ZT的诱导效应0.2-0.5mg/L的ZT对半夏外植体小块茎诱导率分别为73.8%和80.0%，但随着浓度的升高生根率和愈伤组织诱导率都有所增加，叶柄外植体根的诱导率由19.0%增加为64.5%，愈伤组织诱导率由11.9%增至16.7%。当ZT浓度继续升高时，根的诱导率降低，而愈伤组织诱导率提高。当浓度为1.0mg/L时叶柄和叶片生根率分别为46.7%和34.0%,愈伤组织的诱导率分别为25.0%和10.0%；当浓度为2.0mg/L时叶柄和叶片的生根率分别为2.2%和37.3%，愈伤组织的诱导率分别为48.9%和29.4%。2.4小结低浓度的细胞分裂素均有利于植株的再生，且生长势比单因素低浓度的生长素处理长势好，外植体先在边缘产生绿色突起，再由绿色突起分化为大量的小块茎，6-BA效果较好，但叶较小；KT诱导的小块茎萌发的植株叶柄较细，叶片较大。不同浓度的激素搭配也会有不同的影响，以半夏顶芽为外植体诱导愈伤组织，在接种3-5d后，顶芽两端向上跷起，随后有切口的一端膨大。接种10-12d后，可见顶芽有所增长，其切口端出现白色绒毛状物。第15天后，渐渐出现淡黄或透明的松散型愈伤组织。将愈伤组织切下于同样的培养基中进行增殖培养。出愈率可以看出，当NAA浓度相同时，6-BA浓度越大，愈伤组织出愈率越高；当6-BA浓度相同时，NAA为0.2mg/L时，出愈率普遍较高，且试验中观察到6-BA与NAA组合较2,4-D与KT组合的愈伤组织更接近胚性愈伤组织。经过差异显著性分析表明，各处理间的出愈率差异显著，其中出愈率最高的为6-BA2.0mg/L和NAA0.2mg/L为半夏顶芽愈伤组织诱导的最适宜激素浓度。微量元素对半夏外植体诱导的影响在相同诱导培养基中添加不同浓度的Mn、Fe、Zn，以叶片、叶柄和块茎为外植体，研究微量元素对半夏外植体直接诱导形成小块茎的影响。在培养32d后，叶柄在不同培养基上的诱导及分化生长状况不一；不同培养基组合中叶柄诱导率及分化率也不同。通过试验观察统计,不同处理组合对叶柄诱导率在一定范围内影响不很显著，而对叶柄分化率影响很显著。其分化率高可达到74.1%，对照52.8%,且培养基所诱导的愈伤组织为绿色致密的愈伤组织，具有很强的生活力，分化苗生长健壮。其次的培养基，其叶柄两端形成带绿色芽点的愈伤组织，生长健壮。因此，用半夏叶柄作为外植体培养首选锰5.5mg/L,铁7.5mg/L,锌1.0mg/L的培养基，其他的几种培养基培养叶柄后大部分形成白色疏松、或浅黄色水浸状的非胚性愈伤组织，能分化成苗的芽点少，有些培养基培养，叶柄被诱导后不能分化成丛生芽或苗，最后褐化死亡。微量元素作为植物生长必需的营养元素，虽然含量较少，但在代谢过程中与大量元素一样具有很重要的功能。锰是许多酶的活化剂；铁硫蛋白参与氧化还原反应，铁的电子得失在呼吸过程中有非常重要的功能；锌是生长素前身色氨酸合成所必需，缺锌植株内吲哚和丝氨酸不能合成色氨酸，因而不能合成生长素，植物生长受阻⑻。该研究通过对半夏外植体不同部位的培养试验，找到最佳的微量元素组合配方。结果表明：培养叶片叶柄的最佳微量元素浓度水平是：Mn5.5mg/L、Fe为9.5mg/L、Zn为2.0mg/L,培养小块茎的最佳微量元素浓度水平是：Mn7.5mg/L、Fe9.5mg/L、Zn为1.0mg/L。对不同的外植体部位进行组织培养，其所需的微量元素浓度组合不同。根据培养需求，使用相应的培养基组合，这样可以进一步提高半夏试管块茎的诱导分化率，为半夏试管块茎的规模化生产提供技术支持。其他因素对半夏外植体诱导的影响4.1苗龄对外植体诱导的影响在影响半夏出芽的外界因素中，外植体的年龄对植株再生有重要影响9，无菌苗苗龄低，约为10d时，叶片的分化率仅为40%，叶柄分化率达50%，而块茎的分化率最高，可达94%,且接种过程中容易造成机械损伤，使伤口褐化，导致外植体死亡。苗龄过高，如苗龄为45d以上时，叶片和叶柄分化率近于0，块茎的分化率为58%。易形成倒苗，叶片和叶柄老化甚至枯萎，不能用做外植体，生长旺盛期和珠芽成熟期的半夏材料，其外植体的分化率都较高；倒苗期，外植体材料减少，不利于快繁和研究。4.2外植体放置方式对诱导的影响外植体的放置方式对出芽有很大的影响。块茎垂直放置出苗率高，出芽率达82%，水平放置出芽率达40%。叶柄和叶片平放于培养基效果较好，出芽率分别为52%和70%;叶柄垂直插入培养基，出芽低，仅有20%，且出芽速度慢。4.2培养条件对诱导的影响培养条件是半夏离体培养的重要环节，最佳培养温度18-20°C，温度过低，诱导时间延长，诱导率下降；温度过高时，切块容易变黑，若形成愈伤组织其颜色呈淡黄色，容易老化，分化成苗率低。在分化出苗期，光的作用比较明显，光照时间应较长［10］。总结展望植物组织培养作为一项重要的生物技术存在无限的潜力和市场开发价值。半夏的组织培养也还有不少问题需要更进一步探讨研究EM。6.1半夏组织培养条件的完善对于半夏最佳外植体的选择，不同的学者研究的结果有所差异，甚至差异很大，产生的原因可能跟不同学者研究的半夏品种、所选培养基、添加的生长调节物质以及当时培养的外界条件等不同可能有关。植物的生长调节物质特别是生长素类和细胞分裂素类已证实对半夏组织培养有至关重要的作用。但对于愈伤组织的诱导、增殖、器官的分化等最适配比的报道，不同的学者研究的结果也不相一致。所以我们在以后的半夏组培研究中要把品种、培养基、激素、外界条件、实验目的等因素都考虑进来，这样才能更有利于对半夏的组织培养研究。6.2建立和完善半夏的快速繁殖体系利用半夏的组织培养进行快速繁殖，可以一次性获得再生苗。但要想满足市场需求，必须建立半夏的无性系快速繁殖体系。目前这方面的研究虽有报道，但在愈伤组织继代增殖培养过程中，会造成一些遗传变异，改变试管苗的品质。因此要不断的完善和优化相关技术条件。6.3半夏人工种子的研发半夏人工种子的研制成功给半夏的快速繁殖与育种开辟了一个新的领域。目前半夏人工种子的研究也取得了一定的成果，但用小块茎作为人工种子的制作材料对于人工种子的规模生产十分有限，因而应考虑对半夏进行细胞悬浮培养，以获得大量胚状体。进而使半夏人工种子能达到工业化生产的要求。另外用海藻酸钠作为包埋系统保水性差，营养物质易渗漏，也极易染菌，因此难以实际应用，故应选择更适合的材料作为人工种子的种皮，目前，复合型包埋基质是人工种皮材料的发展发向。参考文献：罗广明.半夏的快速繁殖研究[J].中药材,2003(10):26.薛建平，张爱民,盛玮等.钾盐对试管块茎诱导的影响[J].中国中杂志,2006(7):546-548.夏海武，战克勤,赵月玲.半夏组织培养研究[J].中国中药杂志，1994,19(12):720-721.罗光明，刘贤旺，姚振生等.半夏的组织培养和植株再生[J].江西中医学院学报,2000,12(3):125-126.魏莉霞.微量元素对半夏组织培养诱导率及分化率的影响[J].北方园艺,2009,8.254-256王前,王珏,陆远,谷金科,王俊丽,杨林.不同激素及浓度