耳甲区电刺激对CUMS模型大鼠抗抑郁效应及ERK信号通路作用机制

耳甲区电刺激对CUMS模型大鼠抗抑郁效应及ERK信号通路作用机制抑郁症是一个全球性的精神卫生问题,它以心境低落为主要特征,伴有认知功能损害,具有高患病率、高复发率、高自杀率的特点,对人类健康、生活和工作造成严重危害。根据世界卫生组织预测,截至2020年,在影响人类健康、增加社会负担的疾患中,抑郁症将可能跃居全球第二位,造成不同程度的社会财政负担的增加。但迄今为止,对抑郁症病因的认识仍尚未明了。从中医角度来看,虽古代文献并未出现明确的“抑郁症”病名,但归属于“郁证”的范畴,发病内因多为脏气虚弱,并常常由情志不遂所诱发,以肝郁脾虚、心神失养为主要病机;从西医发病机制角度来看,单胺类神经递质假说和神经递质受体假说是目前最主要和最经典的假说,而神经-内分泌系统功能失调、神经可塑性失调、脑源性神经营养因子功能失调、神经免疫功能失调、信号转导通路失调等假说的出现,也逐渐丰富了人们对抑郁症病理机制的理解。关于抑郁症的治疗,临床使用仍然以抗抑郁药物治疗为主(包括三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-HT再摄取抑制剂等),这些抗抑郁药均存在起效慢(需时2-3周)的缺点,和胃肠道反应、头痛、嗜睡或者失眠、性功能障碍等不良反应,但最大缺点是不能及时防范和治疗早期重症抑郁症患者的自杀风险,且大约1/3到2/3患者对初次选用的抗抑郁药无反应。非药物疗法主要包括心理疗法和物理疗法,其中认知行为疗法(CognitiveBehavioralTherapy,CBT)被认为是较为有效的治疗抑郁症的心理治疗方法之一,但其耗时较长,仅能作为药物的辅助治疗方法。迷走神经刺激(VagusNerveStimulation,VNS)疗法作为较为常见的一种物理疗法,于2005年7月正式由美国FDA批准用于难治性抑郁症的治疗,然而,这种外科手术不但费用昂贵、有术后感染风险,且在10周治疗后有效率仅达40%。基于神经解剖学研究显示,耳区特定部位(如耳甲腔和后耳下方乳突上)具有丰富的迷走神经分布,我们课题组多年来致力于经皮耳甲迷走神经刺激(TranscutaneousAuricularVagusNerveStimulation,taVNS)治疗抑郁症的研究,结果显示taVNS可有效缓解抑郁症患者的抑郁/焦虑症状,显著降低汉密尔顿抑郁量表和焦虑量表得分,不仅产生了与VNS相类似的临床疗效,而且有效的克服了有创VNS应用所带来的上述缺陷。taVNS疗法虽然尚处于早期探索及研发阶段,但其在抑郁症治疗的临床科研和实践中已经发挥了备受众人瞩目的重要作用。值得一提的是,常用于治疗抑郁症的耳穴恰好也位于耳迷走神经分布的区域,因此,我们认为耳针和taVNS在某种程度上是在不同理论指导下的相同或相似的诊疗过程。然而,taVNS治疗抑郁症特定频率的选择尚未得到有效评估,且其良好的抗抑郁效应机制也尚未阐明,因此本研究在上述临床和实验的基础之上,试图比较5Hz、20Hz、100Hz三个不同频率taVNS对慢性不可预知性刺激(ChronicUnpredictableMildStress,CUMS)诱导的抑郁模型大鼠行为学(包括糖水偏好实验、强迫游泳实验和旷场实验)、下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HypothalamicPituitaryAdrenal,HPA)功能(包括血浆皮质酮、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素)的影响,从行为学和HPA轴功能状态两个角度评估taVNS抗抑郁效应的优选频率。另一方面,海马体积的缩小是抑郁症发病主要的脑结构改变,细胞外调节蛋白激酶(ExtracellularSignal-RegulatedKinase,ERK)信号转导通路的正常功能状态与神经元的生长、分化、凋亡和增殖密切相关,因此本研究通过探讨ERK通路上、下游蛋白的表达,试图进一步阐释taVNS抗抑郁作用的效应机制。方法实验一不同频率耳甲区电刺激对CUMS抑郁模型大鼠行为学的影响50只健康雄性成年SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供[许可证号:SCXK(京)2014-0013],体重为200±20g。将大鼠随机分为空白组(n=10)、模型组(n=10)、5Hz-taVNS组(n=10)、20Hz-taVNS组(n=10)、100Hz-taVNS组(n=10)。所有大鼠均适应性喂养一周。本实验采用孤养结合7种慢性不可预知性应激刺激的方法,包括:禁水(24小时)、禁食(24小时)、昼夜颠倒(12/12小时)、冰水游泳(0℃,5分钟)、潮湿垫料(24小时)、夹尾(1分钟)、热板(52℃,5分钟),造模时间为21天。每天选取其中一种应激刺激方法,平均每种刺激方式使用2-3次,并且每种刺激不能连续两天发生,以免大鼠对应激刺激产生预见性。耳甲区电刺激是在2%异氟烷吸入麻醉下进行,采用华佗牌电子针疗仪,连接正负自吸附导电磁铁,经皮无创固定于大鼠双侧耳甲腔部,对大鼠进行电刺激干预。作用时间为每天上午9:00-12:00,每天刺激30分钟,频率为5Hz或20Hz或100Hz连续波,刺激强度为2mA,共持续28天。分别于造模前(第-21天)、造模第1(第-14天)、2(第-7天)、3(第0天)周、电刺激的第1(第7天)、2(第14天)、3(第21天)、4(第28天)周检测一次糖水偏好量、强迫游泳不动时间和旷场实验水平运动和垂直运动得分,以评估各组大鼠的抑郁样行为。实验二不同频率耳甲区电刺激对CUMS抑郁模型大鼠HPA轴功能的影响本研究采用21天CUMS方法制作抑郁症模型,并对模型大鼠进行28天不同频率耳甲区电刺激。分组情况、造模及干预方法同实验一。实验结束后,采用Elisa法检测比较各组大鼠血浆皮质酮(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)以及促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)含量,评价不同频率耳甲区电刺激对CUMS抑郁模型大鼠HPA轴功能的影响。实验三耳甲区电刺激对CUMS大鼠海马内ERK信号转导通路的影响30只SD大鼠随机分为空白组(n=5)、模型组(n=5)、taVNS组(n=5)、模型/PD98059组(n=5)、模型/DMSO组(n=5)、模型/PD98059/taVNS组(n=5)。采用21天CUMS方法制作抑郁症模型(造模方法同实验一),侧脑室注射ERK信号通路阻断剂PD98059或有机溶剂DMSO,taVNS持续干预28天。实验结束后处死动物,取各组大鼠海马组织,使用Westernblot方法检测Raf、p-Raf、ERK、p-ERK、RSK、CREB、p-CREB蛋白表达水平,探讨taVNS对抑郁模型大鼠海马ERK信号转导通路的影响,探索taVNS抗抑郁效应的作用机制和作用靶点。结果实验一不同频率耳甲区电刺激对CUMS抑郁模型大鼠行为学的影响1.不同频率耳甲区电刺激对CUMS抑郁模型大鼠糖水偏好的影响结果显示,实验开始前(第-21天)各组大鼠糖水偏好未见明显统计学差异(P>0.05),组间具有可比性。从造模第-14天到第0天,模型组、5Hz-taVNS组、20Hz-taVNS组和100Hz-taVNS组比空白组大鼠糖水偏好明显下降(P<0.01),显示造模成功;电刺激第21天和第28天,20Hz-taVNS组大鼠与模型组相比,糖水偏好量均明显升高(P<0.01,P<0.05),而5Hz-taVNS和100Hz-taVNS与模型组相比未见明显差异(P>0.05)。2.不同频率耳甲区电刺激对CUMS抑郁模型大鼠强迫游泳不动时间的影响结果显示,实验开始前(第-21天)各组大鼠强迫游泳不动时间未见明显统计学差异(P>0.05),具有组间可比性。从造模第-14天到第0天,与空白组相比,模型组、5Hz-taVNS、20Hz-taVNS和1OOHz-taVNS组大鼠强迫游泳不动时间明显升高(P<0.01),表现出明显的抑郁样行为;电刺激第28天,20Hz-taVNS组大鼠强迫游泳不动时间与模型组比较明显下降(P<0.05),5Hz-taVNS和100Hz-taVNS与模型组相比未见明显差异(P>0.05)。3.不同频率耳甲区电刺激对CUMS抑郁模型大鼠旷场实验得分的影响结果显示,实验开始前(第-21天)各组大鼠旷场实验水平运动和垂直运动得分均未见明显统计学差异(P>0.05),组间具有可比性。从造模第-14天到第0天,模型组、5Hz-taVNS、20Hz-taVNS和100Hz-taVNS组大鼠与空白组相比水平运动和垂直运动得分均明显下降(P<0.01),表现出明显的抑郁样行为;电刺激第21天,20Hz-taVNS组大鼠水平运动得分明显高于模型组(P<0.05),垂直运动得分没有明显变化(P>0.05);电刺激第28天,20Hz-taVNS组大鼠水平运动和垂直运动得分均明显升高(P<0.01),而5Hz-taVNS和100Hz-taVNS与模型组相比未见明显差异(P>0.05)。实验二不同频率耳甲区电刺激对CUMS抑郁大鼠HPA轴功能的影响结果显示,与空白组大鼠相比,抑郁模型组大鼠CORT、ACTH含量明显升高(P<0.01,P<0.01),20Hz-taVNS组与模型组相比二者明显降低(P<0.01,P<0.01),而5Hz-taVNS和100Hz-taVNS组与模型组比较均未见明显统计学差异(P>0.05)。关于血浆CRF含量,各组间比较均未见明显统计学差异(P>0.05),但模型组与空白组相比,CRF含量呈现出升高趋势,且20Hz-taVNS组大鼠血浆CRF与空白组含量相当。实验三耳甲区电刺激对CUMS抑郁模型大鼠海马内ERK信号转导通路的影响1.不同时间点各组大鼠糖水偏好量比较结果显示,实验开始前(第-21天)各组大鼠糖水偏好量未见明显统计学差异(P>0.05),具有组间可比性。连续21天CUMS诱导后(第0天),与空白组比较,模型组、M/taVNS组、M/PD组、M/DMSO组、M/PD/taVNS组大鼠糖水偏好量均明显下降(P<0.01),表明抑郁模型制作成功。各组大鼠经过不同干预处理后(第28天),与空白组比较,模型组、M/PD组、M/DMSO组和M/PD/taVNS组均明显下降(P<0.01),而M/taVNS组未见明显差异(P>0.05);与模型组比较,仅M/taVNS组明显升高(P<0.05),其余各组均无差异(P>0.05);与M/taVNS组比较,M/PD组、M/DMSO组和M/PD/taVNS组均明显下降(P<0.05、P<0.05、P<0.01),且与模型组无统计学差异(P>0.05)。2.各组大鼠海马区Raf和p-Raf蛋白的表达实验结束后(第28天)处死大鼠,取海马组织,使用Westernblot方法检测Raf和p-Raf蛋白的表达。Raf蛋白表达:与空白组比较,模型组、M/PD组、M/DMSO组、M/PD/taVNS组均明显下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05),而M/taVNS组无统计学差异(P>0.05);与模型组比较,M/taVNS组和M/PD/taVNS组均明显升高(P<0.05、p<0.05);与M/taVNS组比较,M/PD组和M/DMSO组均明显下降(P<0.05、P<0.05),而其余各组未见显著性差异(P>0.05)。p-Raf蛋白表达:与空白组比较,模型组、M/PD组、M/DMSO组均明显下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01);与模型组比较,M/taVNS组和M/PD/taVNS组均明显升高(P<0.01、P<0.01);与M/taVNS组比较,M/PD组和M/DMSO组均明显下降(P<0.01、P<0.01),其余各组均未见明显差异(P>0.05)。3.各组大鼠海马区ERK和p-ERK蛋白表达比较实验结束后(第28天)处死大鼠,使用Westernblot方法检测各组大鼠海马区ERK和p-ERK蛋白的表达。ERK蛋白表达:与空白组比较,模型组、M/PD组和M/DMSO组均明显下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01);与模型组比较,M/taVNS组和M/PD/taVNS组均明显升高(P<0.05、P<0.05);与M/taVNS组比较,M/DMSO组明显下降(P<0.05),其余各组未见显著性差异(P>0.05)。p-ERK蛋白表达:与空白组比较,模型组、M/PD组、M/DMSO组和M/PD/taVNS组均明显下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01);与模型组比较,M/taVNS组明显升高(P<0.01),而M/PD组明显下降(P<0.05);与M/taVNS组比较,M/PD组、M/DMSO组和M/PD/taVNS组均明显下降(P<0.01、P<0.01、P<0.05),其余各组均未见显著性差异(P>0.05)。4.各组大鼠海马区Rsk蛋白表达比较实验结束后(第28天)处死大鼠,取各组大鼠海马组织,使用Westernblot方法检测Rsk蛋白的表达情况。结果显示,与空白组比较,模型组、M/PD组、M/DMSO组和M/PD/taVNS组均明显下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01);与模型组比较,M/taVNS组明显升高(P<0.01);与M/taVNS组比较,M/PD组、M/DMSO组和M/PD/taVNS组均明显下降(P<0.05、P<0.05、P<0.01),其余各组未见显著性差异(P>0.05)。5.各组大鼠海马区CREB和p-CREB蛋白表达比较实验结束后(第28天)处死大鼠,使用Westernblot方法检测各组大鼠海马区CREB和p-CREB蛋白的表达。CREB蛋白表达:与空白组比较,模型组、M/PD组、M/DMSO组和M/PD/taVNS组均明显下降(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.01);与模型组比较,M/taVNS组和M/PD/taVNS组均明显升高(P