人工栽培羊肚菌的鉴定

人工栽培羊肚菌的鉴定王波;鲜灵【摘要】羊肚菌人工栽培已成功，但栽培的羊肚菌分类地位不明确.本文对人工栽培的羊肚菌进行了形态特征描述和ITSrDNA序列分析.结果表明，人工栽培羊肚菌为梯纹羊肚菌Morchellaimportuna,运用分子生物学技术进行鉴定,并与GenBank中下载的羊肚菌属种建立了系统发育树.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷)，期】2013(026)005【总页数】4页(P1988-1991)【关键词】梯纹羊肚菌;形态特征;rDNAITS;系统发育【作者】王波鲜灵【作者单位】四川省农业科学院土壤肥料研究所,四川成都610066;四川省农业科学院土壤肥料研究所,四川成都610066【正文语种】中文【中图分类】S626羊肚菌类大多数为美味食用菌，是全球六大最珍贵食用菌之一，在欧洲，被认为是仅次于黑孢块菌的美味食用菌；在北美，被认为是最佳食用菌［1］，羊肚菌是我国重要出口食用菌产品。世界上记载有28个种［2］,其中我国记载羊肚菌属有11个种，分别为黑脉羊肚菌MorchellaangusticeosPeck，脉肋羊肚菌M.costata(Vent.)Pers.，粗腿羊肚菌M.crassipes，小羊肚菌M.deliciosaFr.，高羊肚菌M.elataFr.，高羊肚菌紫褐变种M.elatavar.purpurasensKrombh.(=M.purpurascens(Krombh.exBoud.)Jacquet.)，羊肚菌M.esculenta(L.)Pers.(=M.rotunda(Fr.)Boud.，羊肚菌坚挺变种M.esculentavar.rigida(Krombh.)I.R.Halletal.，羊肚菌褐赭色变种M.esculentaar.umbrina(Boud.)S.Imai(=M.umbrinaBoud.)，薄棱羊肚菌M.miyabeanaS.Imai，普通羊肚菌M.vulgaris(Pers.)Boud.(=M.conicaPers.)等［3］。有关羊肚菌的人工栽培成功报道距今有100多年历史。我国和美国均人工栽培成功羊肚菌，美国利用工厂进行了栽培；我国在田间栽培成功出羊肚菌，云南是利用段木栽培羊肚菌［4］，而四川是利用耕地栽培羊肚菌；我国人工在栽培的羊肚菌属种有尖顶羊肚菌［5~6］，羊肚菌等，由于未见形态特征和分子标记鉴定证据，人工栽培的羊肚菌是何种？有必要鉴定出其种名。羊肚菌的鉴定方法有形态学和分子标记鉴定，由于人工栽培羊肚菌属种的子囊果形态特征与野生的存在差异，人工栽培的羊肚菌属种有的个体大、有圆形、锥形等，仅从形态特征上是难以准确鉴定的，还需以分子标记进行辅助鉴定，在分子标记鉴定上已开展了大量的研究，利用ITSrDNA序列鉴定的较多，建立了羊肚菌属种的系统发育树［7~8］，对我国羊肚菌系统发育研究表明，发现中国有30种羊肚菌，其中有20个为本地种，9个种在欧洲也有分布，4个种可能是火烧适应种［9］;为了快速鉴定出羊肚菌物种，建立了网络参考数据库［10］。1材料与方法1.1材料来源鉴定的样品分别来自崇州市、郫县、大邑县、涪城区等地的人工栽培的〃羊肚菌”子囊果，编号分别为WB201、WB202、WB203、WB204。标本保藏在四川省农业科学院土壤巴料研究所。1.2形态特征鉴定方法对羊肚菌子实体进行了子实体的外观形态和显微形态特征观察，纪录形态特征。1.3分子标记鉴定方法1.3.1基因组DNA提取方法以鲜子实体为材料，利用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。1.3.2ITS序列分析采用真菌通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)。反应体系为50pl，该体系包括2xPCRMasterMix25Ml,Primer(0.2pmol/L)各1.5pl;模板DNA1pl,加ddH2O补齐50pl。在BioRadMyCycle型PCR仪上扩增，PCR程序设定:94°C,3min(预变性);94^变性1min,54°C下退火lmin,72°C延伸2min;共计35个循环；循环结束后在72°C延伸8min。1.3.3测序将ITS-PCR产物进行纯化，操作方法依试剂盒的操作手册进行，纯化后的PCR扩增产物和引物直接测序，测序由上海英俊生物技术有限公司完成。1.3.4ITS序列分析根据文献报道的羊肚菌属种［10］，从GenBank数据库中下载羊肚菌属12个种的ITS序列，将所测序列与从GenBank中下载羊肚菌属种类序列进行比对后，使用Mega4.0软件中NJ法构建系统发育关系树。2结果与分析2.1子实体形态特征对采集纸四川大邑县、崇州市、郫县和涪城区的人工栽培的羊肚菌进行了形态特征描述，4个地区采集的羊肚菌在子实体形态特征上无明显区别，子实体菌盖为灰黑色、锥形，纵棱纵向排列，较规则，横棱不规则，纵棱和横棱交接形成似梯子状横隔，凹坑深，菌盖长8.2~10.5cm，直径2.0~2.8cm;菌盖与菌柄离生，菌盖中空，菌柄柱状，菌柄稍膨大，中空，白色，菌柄长度3.7~4.0cm，直径1.0~1.3cm。子囊棒状，无色，每个子囊内有8个子囊孢子，纵向或重叠排列，大小为162-200|jmx16.2~20.0pm;侧丝棒状，顶端膨大，大小为80.01-112.5|jmx7.5~10.0pm;子囊孢子椭圆形，无色，大小为10~16pmx7.5~12.5pm（图1）。2.2ITS扩增对4个羊肚菌属种样品进行基因组DNA提取后，通过ITS4、ITS5引物进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检验，通过DNAMarker（DL2000）分子量估算，检测的羊肚菌属种4个样品的ITS条带在750bp左右（图2）。图1人工栽培羊肚菌子囊果形态特彳正Fig.1MorphologicalcharacteristicsofthecultivatedMorchellaascocarpA:子囊果生长情况；B:子囊果形态特征；C:侧丝；D:子囊孢子；E:子囊A:Growthsituationofascocarp;B:macromorphologicalfeaturesofascocarp；C:Paraphysis；D:Ascospore；E:Ascus图24个羊肚菌样品的ITS电泳图谱Fig.2Theelectrophoretogramof4Morchellasp.amplifiedwithprimerITS4andITS52.3羊肚菌属种的系统发育分析采用Neighbor-Joining法构建4个羊肚菌和GenBank中下载的12个羊肚菌属种的基于ITS系列的系统发育树状图（图3）。待鉴定的羊肚菌4个样品与Morchellaimportuna在同一个分枝上，其序列系相似性为100%，而与其它羊肚菌属的8个种在不同分枝上，尖顶羊肚菌与待鉴定的羊肚菌序列相似性较小，分别在不同分枝上，按照Renske（2003）的观点，当序列相似性＞99%时，为相同物种，因此，待鉴定的4个人工栽培羊肚菌应为梯纹羊肚菌Morchellaimportuna，而不是尖顶羊肚菌。3讨论羊肚菌人工栽培已取得成功，在四川已大面积栽培出羊肚菌，一般产量达到1500kg/hm2，高的达到3000kg/hm2。人工栽培的羊肚菌大部分认为是尖顶羊肚菌，由于缺乏分子标记的证据，加上人工栽培的羊肚菌子囊果个体之间差异较大，难以根据系统特性鉴定出种名，将形态特征与ITSrDNA序列结合进行鉴定，才能准确定其分类地位。将人工栽培的羊肚菌ITSrDNA序列与GenBank中记载的已准确鉴定的羊肚菌物种的序列进行分析，发现待鉴定的人工栽培的羊肚菌4个标本的DNA序列与梯纹羊肚菌相似性达到100%，而与羊肚菌其它物种差异显著，梯纹羊肚菌只在我国云南和河南有分布，在四川还未见有报道。由于GenBank中登载的羊肚菌属种序列有66%是错误的[10],因此，利用GenBank中记载的羊肚菌属种的序列进行比较鉴定时，应选择已发表论文或专业科技人员鉴定后提交的序列。人工栽培的羊肚菌物种鉴定为梯纹羊肚菌，表明梯纹羊肚菌易进行人工栽培，因此，我们在开展羊肚菌人工栽培研究时，应对定向采集梯纹羊肚菌，对其进行菌种分离培养，通过系统筛选可获得高产优质的品种，同时，对其生态习性进行调查，掌握其生态习性对指导人工栽培羊肚菌具有较大作用。图3基于羊肚菌ITSrDNA序列的NJ系统发育树Fig.3NJphylogenetictreeofITSrDNAregionsequencesofMorchellaspp.人工栽培成功的羊肚菌为主要梯纹羊肚菌，而其它羊肚菌物种是否也能进行人工栽培，还有待于开展人工栽培试验。目前人工栽培羊肚菌是在耕地内，利用自然气候栽培，产量和产品质量受环境的影响较大，稳定性较差，因此，还有待开展高产栽培技术研究和工厂化栽培技术研究，研究建立羊肚菌的高产、稳产技术体系，是开展规模化人工栽培羊肚菌的关键。【相关文献】[1]AlexopoulosCJ,BlaackwellM,MimsCW.IntroductoryMycology4thedn[C].JohnWiley&SonsInc,1996.[2]KirkPM,CannornPF,DavidJC,etal.Ainsworth&Bisby’sDictionaryofthefungi.9thEdn[C].CABInternational,Wallingford,2001.戴玉成，周丽伟，杨祝良，等.中国食用菌名录[J].菌物学报，2010,29(1):1-21.赵琪，黄韵婷，徐中志，等.羊肚菌栽培研究现状[J].云南农业大学学报，2010,24(6):904-907.程远辉，赵琪，杨祝良，等.利用圆叶杨菌材栽培羊肚菌初报[J].中国农学通报，2009,25(21):170-172.[6]赵丹丹，李凌飞，赵永昌，等.尖顶羊肚菌人工栽培[J].食用菌学报，2012,17(1):32-35.沈洪，陈明杰，赵永昌，等.云南羊肚菌rDNA的ITS序列与亲缘关系分析[J].食用菌学报,2007,14(2):15-18.戴璐，李峻志，李安利，等.基于ITS序列分析对秦岭冷水沟羊肚菌的鉴定[J].中国食用菌,2010,29(6):45-46.[9]Xi-HuiDU,QiZhao,KerryO’Donnell,etal.Multigenemolecularphylogeneticsrevealstruemorls(Morchella)areespeciallyspe