菜心品种纯度鉴定简单重复序列间区法规程

菜心品种纯度鉴定简单重复序列间区法规程本文件规定了菜心品种纯度鉴定的实验方法。本文件适用于利用简单重复序列间区法（ISSR）对大豆种子品种鉴定的实验过程。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1简单重复序列间区experimentalidentification根据某个简单重复序列（微卫星位点）设计出一系列特异引物，通过PCR反应扩增微卫星位点间隔的碱基顺序的分子标记和检测方法。3.2引物primer一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，提供3’一OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。3.3微卫星DNAmicrosatelliteDNA是一类由几个核苷酸（一般为1个、5个）为重复单位的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列。4原理DNA是生物体的遗传基础，携带所有的遗传物质，从DNA分子水平上进行鉴别是区分物种、品种甚至个体之间差异最为有效的方法。利用PCR技术可将DNA片段在短时间内扩增几十甚至几百万倍，从而达到可以检测的目的。ISSR方法是在PCR技术基础上发展起来的一种检测方法，是根据简单重复序列（微卫星位点）设计出一系列特异引物，包括双核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等为重复单位的微卫星DNA片段（一般为20个碱基），通过PCR反应扩增微卫星位点及其间隔区，以检测其扩增片段的多态性。5环境条件5.1温度：15℃、25℃;5.2湿度：相对湿度（RH）≤50％。2T/GXASXXXX—20206仪器设备6.1PCR扩增仪。6.2紫外分光光度计。6.3高速台式离心机：转速不小于15000r/min。6.4多用电泳仪及水平式电泳槽。6.5紫外透射仪。6.6微量移液器。6.7电子天平：分度值为0.0001g。6.8磁力加热搅拌器。6.9凝胶成像系统。6.10超纯水系统。6.11灭菌锅。6.12酸度计。6.13微波炉。6.14恒温水浴锅。6.15恒温干燥箱。6.16离心管。6.17研钵。6.18移液器吸头。6.19容量瓶。6.20烧杯。6.21三角烧瓶。6.22PE手套。6.23锡箔纸。6.24封口膜。7试剂7.1TaqDNA聚合酶：保存条件为20℃±2℃。7.210×Buffer：保存条件为20℃士2℃。7.3四种脱氧核苷酸（4×dNTP)：保存条件为20℃士2℃。7.4Mg2+：保存条件为20℃士2℃。7.5RNA酶：保存条件为20℃士2℃。7.6琼脂糖。7.7三羟甲基氨基甲烷。7.8溴酚蓝。7.9二甲苯青FF。7.108·羟基喹啉。7.11十二烷基磺酸钠。7.12溴化乙锭。7.13异戊醇。7.14结晶酚。7.15三氯甲烷。7.16硼酸；7.17蔗糖。7.18无水乙醇。7.19盐酸。7.20氯化钠。7.21去离子水。8鉴定步骤8.1高压灭菌将欲灭菌的离心管放入烧杯中，用锡箔纸封口，移液器吸头装在吸头盒内，配好的试剂装入试剂瓶中，盖好盖，放入灭菌锅中。首先将压力升至1Pa，放气，再将压力重新升至1Pa，开始计时，20min后，将电源关闭。待压力为零时，取出离心管、吸头及试剂瓶，待用。8.2溶液配制相关溶液配制方法见附录A。8.3DNA的提取具体步骤如下：a)取新鲜或冷冻叶片100mg，放在1.5ml离心管中，加入1000匀浆缓冲液浸泡4h，倒入研钵中充分研磨，将研磨产物倒入1.5ml离心管中，取少量匀浆缓冲液冲洗研钵，一并倒入离心管中，离心（转速为4000r/min）10min，将上清液移至新的1.5ml离心管中，弃沉淀。b)加入与上清液等体积的饱和酚，缓慢颠倒离心管20min，不应该剧烈振荡。离心（转速为8000r/min)10min，将上清液移至新的离心管中。c)加入与上清液等体积的酚一三氯甲烷一异戊醇（体积比为24:23:1)，离心（转速为8000r/min)10min，将上清液移至新的离心管中。d)加入与上清液等体积的三氯甲烷一异戊醇（体积比为23:1)，缓慢颠倒10min，离心（转速为8000r/min)10min，取上清液至新的离心管中。e)加入上清液二倍体积的冰冷乙醇，水平旋转离心管50圈、100圈，即可出现白色絮状DNA。f)将离心管置于20℃冰箱中30h，取出后离心（转速为8000r/min)10h，形成白色沉淀。g)倒掉离心管中的液体，加入1mL75％乙醇，离心（转速为15000r/min)5min，倒掉乙醇，倒置在干净的吸水纸上，吸干液体。h)将离心管置于恒温干燥箱（40℃、50℃)中20min或置于通风处40min。i)加入100LTE缓冲液和RNA酶2L，水浴（55℃士2℃)12h，使DNA沉淀充分溶解，4℃冰箱中保存。8.4DNA浓度检测8.4.1紫外吸收检测DNA分子中的嘌呤环和嘧啶环能够吸收紫外光。DNA的紫外吸收高峰在波长260nm处，蛋白质的紫外吸收高峰在波长280nm处。取提取的DNA溶液5L，加水995L，放人比色杯中，用紫外分光光度计检测，4T/GXASXXXX—2020记下260nm和280nm下的OD值，计算出DNA的浓度以及(1)60和01)80的比值。DNA的0D260/OD280宜在1.8，1.5以上也可用于ISSR叩CR分析，若比值太小应重复8.3中a）～i）步骤继续抽提。8.4.2DNA浓度计算按公式（1)计算：D=50×1000×OD260×s……(1)式中：D——DNA的浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）；S——稀释倍数。8.5凝胶电泳检测将制备好的浓度为0.7‰的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，使点样孔处于电源负极端，加入没过胶面1mm深的足量电泳缓冲液（0.5×TBE）。取DNA溶液10L和凝胶加样缓冲液2L，在封口膜上用微量移液器上下吸打混匀，加入到点样孔中（注意避免出现气泡）。打开电源，将电压控制在5V/cm,电泳1h，取出凝胶，放在紫外透射仪上观察。若DNA质量好、分子量高50kb）且无降解，在点样孔附近呈现一条致密亮带；若DNA部分降解，则呈连续分布状态多若严重降解，则看不到大片段DNA，只能在远离加样孔的地方看到RNA。8.6ISSR扩增8.6.1反应成分25反应体系中，含有1XBuffer,1.5mmol/LMg2+，200μmoI/LdNTP,1UTaqDNA聚合酶，1μmoI/L引物，100ng模板DNA,加水至25μL。按上述比例将反应液依次加入0.2mL离心管中，放人PCR仪中，进行PCR循环。8.6.1.1循环过程94℃预变性7min；94℃变性30s,48℃退火45s，45个循环；72℃延伸s；72℃延伸7min；4℃冷却。8.7电泳检测将制备好的浓度为2％的琼脂糖凝胶放人电泳槽中，使点样孔处于电源负极端。取PCR扩增产物10μL和凝胶加样缓冲液2L，在封口膜上用微量移液器上下吸打混匀，加入到点样孔中。打开电源，将电压控制在3V/cm,电泳4h，切断电源，取出凝胶，在凝胶成像上扫描。8.8鉴定将待测品种的凝胶成像结果与该品种原种的标准谱带相比较，从而鉴定出该品种的真实性。（规范性附录）缓冲液和主要试剂的配制A.1匀浆缓冲液的配制A.1.1取1mol/LTris.CI(pH8.0）200mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0）50mL和0.5gSDS,加水至100mL。使用前应保证SDS充分溶解，若出现结晶，应放在50℃水浴中溶解10min。A.1.21mol/LTris·Cl(pH8.0)：称取12.11gTris，溶于80mL水中，用浓HCl调节溶液的pH值至8.0，加水定容至100mL，高压灭菌。A.1.30.5mol/LEDTA(pH8.0):称取18.61gEDTANa2·2H20，溶于80mL水中，在磁力加热搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH2g左右调节溶液的pH值至8.0，加水定容至100mL，高压灭菌。A.2饱和酚的制备饱和酚的制备宜在通风橱或通风良好的条件下进行。A.3TE缓冲液的配制A.3.11mol/LTris.CI(pH7.6称取12.11gTris，溶于80mL水中，用浓HCI调节溶液的pH值至7.6，加水定容至100mL，高压灭菌。A.3.20.5mol/LEDTA(pH8.O):同A.1.3。A.4RNA酶(10mg/mL）的配制称取RNA酶1mg,溶于100TE缓冲液中，70℃水浴10min，缓慢冷却至室温。A.5琼脂糖凝胶的配制A.5.1将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.82在微波炉中融化，加入5μLGoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡，冷却至不烫手时倒入已封口并放好梳子（距底板1.0mm左右）的载胶板上，凝胶厚度在3mm、5mm为宜，待凝胶完全凝固后放入电泳槽中备用。