大黄、关黄柏、泽兰、侧柏叶及双柏喷膜剂经皮渗透特征图谱特性研究

大黄、关黄柏、泽兰、侧柏叶及双柏喷膜剂经皮渗透特征图谱特性研究双柏散是广州中医药大学的经验方,该方由大黄、侧柏叶、关黄柏、泽兰、薄荷等五味药组成,具有活血化瘀、清热解毒、消肿止痛之功效,在临床上被广泛应用于急性软组织损伤、疮疡、褥疮、骨折、静脉炎等疾病的治疗。课题组针对双柏散传统剂型的不足,研制出双柏喷膜剂,该剂型兼顾了喷雾剂和膜剂的双重优点。本研究在课题组前期对双柏散及组方药味进行了经皮渗透初步研究的基础上,进一步优化特征图谱分析方法及经皮渗透参数,研究大黄、关黄柏、泽兰、侧柏叶及双柏喷膜剂经皮渗透特征图谱,探讨中药不同类型成分群经皮渗透的特性。目的：1、建立大黄、关黄柏、泽兰及侧柏叶的HPLC特征图谱分析方法,为质量控制及经皮渗透试验提供分析手段；分析该四味中药及其提取物HPLC特征图谱的相关性。2、建立双柏喷膜剂HPLC特征图谱分析方法,拟定不同类成分群的特征图谱,为质量控制及经皮渗透试验提供分析手段。3、采用中药特征图谱技术与经皮渗透试验相结合的方法,分别建立大黄、关黄柏、泽兰及侧柏叶醇提物及水煎液的经皮渗透特征图谱,探讨中药不同类成分群的经皮渗透特性,比较薄荷脑对不同类成分群的促透影响。4、建立双柏喷膜剂不同类成分群的经皮渗透特征图谱,探讨双柏喷膜剂中不同类成分群的经皮渗透特性；通过双柏喷膜剂与单味药透过率常数的比较,阐明双柏喷膜剂经皮渗透优势及工艺合理性。方法：1、采用中药HPLC特征图谱技术,建立大黄、关黄柏、泽兰及侧柏叶HPLC特征图谱分析方法；采用国家药典委员会中药色谱特征图谱相似度评价系统软件(2004A版),分析该四味中药与其提取物特征图谱的相关性。2、采用两种检测波长建立双柏喷膜剂的HPLC特征图谱,430nm波长分析蒽醌类成分,280nnm波长分析酚酸类、生物碱类、黄酮类及其他类成分群。3、应用体外经皮渗透试验方法,研究大黄、关黄柏、泽兰、侧柏叶的醇提物与其水煎液及双柏喷膜剂的经皮渗透特性。采用Franze扩散池法,以离体裸鼠腹皮为透皮屏障,生理盐水为接收液,接收液收集时间段为2、4、6、8、10、12h；根据临床使用习惯,调整醇溶液、水煎液的试验温度分别为(32±0.5)℃、(37±0.5)℃。采用建立的HPLC特征图谱分析方法,分析各样品经皮渗透前后的特征图谱；采用SPSS软件的相关系数法分析样品经皮渗透前后特征图谱的相似度。4、结合中药特征图谱技术与经皮渗透试验方法,参考主成分经皮渗透参数的计算方法,根据各样品经皮渗透前后供试品溶液的特征峰面积,拟定经皮渗透特征图谱的参数：(1)特征峰累积透过折算峰面积(QA)；(2)特征峰面积累积透过率(QA%)；(3)特征峰累积透过率-时间零级方程(QA%-JA*t+B)、特征峰透过率常数(JA,h-1)及零级方程相关系数r,；(4)特征峰累积透过率-时间一级方程(OA%=JB*t1/2+C)及一级方程相关系数r2。成果：1、优化了大黄、关黄柏、泽兰及侧柏叶的HPLC特征图谱分析方法,分析了该四味中药及其提取物特征图谱的相关性。(1)优选430nm.280nm两种检测波长,分别对大黄蒽醌类及其他类成分进行了HPLC特征图谱的分析研究。在430nm波长下,标示出14个蒽醌类共有峰,鉴别了5个游离蒽醌类成分(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)；在280nm波长下,标示出10个共有峰,鉴别了2个特征成分(没食子酸、儿茶素)；同批次大黄及醇提液在430nm.280nm波长下的相似度分别为0.992-0.999、0.987～0.999,提示常规醇提工艺能保留大黄的主要特征成分。(2)关黄柏标示出18个共有峰,关黄柏精制提取物能检出关黄柏中的15～17个共有峰,鉴别了4个特征峰(木兰碱、药根碱、巴马汀、小檗碱)；同批次关黄柏及其精制提取物之间的相似度为0.926～0.999,提示醇提大孔树脂精制工艺能保留关黄柏的主要特征成分。(3)泽兰及其精制提取物均标示出20个共有峰,鉴别了1个特征峰(咖啡酸)；同批次泽兰及其精制提取物之间的相似度为0.988～0.998,提示醇提大孔树脂精制工艺基本能保留泽兰的主要特征成分。(4)侧柏叶及其提取物均标示出18个共有峰,鉴别了2个特征峰(槲皮苷、槲皮素)；同批次侧柏叶及其水煎液之间的相似度为0.779～0.985,提示水煎煮基本能保留侧柏叶的主要特征成分,但特征峰相对比值变化较大。2、建立了大黄、关黄柏、泽兰、侧柏叶等醇溶液、含0.1%薄荷脑醇溶液及水煎液的经皮渗透特征图谱,获得了四味中药主要成分群的经皮渗透特性。(1)430nm波长下,大黄醇溶液及水煎液的蒽醌类成分群基本能经皮渗透,但经皮渗透前后特征图谱的特征峰相对比值差异均很大,相似度仅为0.394～0.568,而不同时间段接收液之间的相似度则大于0.84。大黄低、中、高三种浓度醇溶液的10个蒽醌类特征峰的透过率常数JA为0.003～0.183,相差约61倍；其中峰5、峰7(大黄酸)、峰6(芦荟大黄素)的JA较大,分别为0.069～0.183、0.036～0.118、0.021-0.034,其他峰的JA小于0.029；峰8(大黄素)、峰9(大黄酚)及峰10(大黄素甲醚)的JA仅为0.003～0.012,基本小于其他蒽醌类特征峰。加0.1%薄荷脑后,大黄醇溶液蒽醌类特征峰的JA增加0.02～0.90倍；大黄水煎液蒽醌类成分的经皮渗透性能明显优于醇溶液。280nm波长下,大黄醇溶液及水煎液的酚酸类及其他成分群基本能经皮渗透,但经皮渗透前后特征图谱的特征峰相对比值差异均很大,相似度小于0.766,而不同时间段接收液之间的相似度则大于0.49。大黄低、中、高三种浓度醇溶液的10个酚酸类及其他类成分特征峰的透过率常数JA为0.023～1.199,相差约52倍；其中峰1～峰2的JA为0.036～0.238,峰9的JA较大,均大于0.36,明显大于其他9个特征峰；加0.1%薄荷脑后,大黄醇溶液酚酸及其他类成分特征峰的JA基本增加0.02～0.37倍；大黄水煎液中的经皮渗透性能类似醇溶液。(2)关黄柏醇溶液及水煎液的生物碱类及其他类成分群基本能经皮渗透,经皮渗透前后特征图谱的特征峰相对比值差异均较小,相似度为0.881～0.969,而不同时间段接收液之间的相似度则为0.841-0.999,相似度较高。关黄柏低、中、高三种浓度醇溶液的13个生物碱类特征峰的透过率常数JA为0.041～1.651,其中峰4(木兰碱)、峰10(药根碱)和峰11(巴马汀)及峰12(小檗碱)的JA分别大于0.06、0.05、0.06、0.07,而峰13的JA较大,均大于0.94；加0.1%薄荷脑后,关黄柏醇溶液生物碱类特征峰的JA增加0,01～1.08倍；关黄柏水煎液生物碱类成分的经皮渗透性能类似醇溶液,但与醇提液相比,其JA相对较小,经皮渗透性能相对较差。(3)泽兰醇溶液及水煎液的酚酸类及其他类成分群基本能经皮渗透,醇溶液经皮渗透前后特征图谱的特征峰相对比值差异均很大,相似度为0.465～0.915,而不同时间段接收液之间的相似度则为0.564-0.999。泽兰醇溶液、含0.1%薄荷脑醇溶液及水煎液的12个酚酸类及其他类成分特征峰的透过率常数JA为0.006～0.329,其中峰2(咖啡酸)的JA较大,为0.097～0.235；加0.1%薄荷脑后,除了峰1的JA促透倍数增加很大外,泽兰醇溶液酚酸类及其他类成分特征峰的JA增加0.07～1.82倍；泽兰水煎液酚酸类及其他类成分的经皮渗透性能类似醇溶液,但与醇提液相比,JA相对较大,其经皮渗透性能相对较好。(4)侧柏叶醇溶液及水煎液的黄酮类及其他类成分群基本能经皮渗透,经皮渗透前后特征图谱的特征峰相对比值差异均很大,相似度为0.158～0.918,而不同时间段接收液之间的相似度则为0.634～0.992。侧柏叶醇溶液、含0.1%薄荷脑醇溶液及水煎液的12个黄酮类及其他类成分特征峰的透过率常数JA为0.006～0.346,其中峰11(槲皮苷)的JA为0.006～0.053；加0.1%薄荷脑后,侧柏叶醇溶液黄酮类及其他类成分特征峰的JA增加0.26～6.06倍,其中,峰11(槲皮苷)、峰13(槲皮素)的JA分别增加3.55、2.37倍；侧柏叶水煎液黄酮类及其他类成分的经皮渗透性能类似醇溶液,但与醇提液相比,JA相对较大,其经皮渗透性能较好。3、建立了双柏喷膜剂的经皮渗透特征图谱,获得了双柏喷膜剂主要成分群的经皮渗透特性。(1)430nm波长下,双柏喷膜剂蒽醌类成分群基本能经皮渗透,但经皮渗透前后特征图谱的特征峰相对比值差异较大,相似度为0.793,而不同时间段接收液之间的相似度则为0.988～0.998。双柏喷膜剂10个蒽醌类特征峰的透过率常数JA为0.012～0.696,峰1～峰7的JA为0.130-0.696,其中峰5、峰6(芦荟大黄素)和峰7(大黄酸)的JA较大,分别为0.366、0.391、0.696,明显大于其他蒽醌类特征峰；而峰8(大黄素)、峰9(大黄酚)及峰10(大黄素甲醚)的JA分别为0.028、0.048、0.012,明显小于其他蒽醌类特征峰。(2)280nm波长下,双柏喷膜剂酚酸类、生物碱类、黄酮类及其他类成分群基本能经皮渗透,但经皮渗透前后特征图谱的特征峰相对比值差异很大,相似度仅为0.409,而不同时间段接收液之间的相似度则为0.986～0.999,双柏喷膜剂18个酚酸类、生物碱类、黄酮类及其他类成分特征峰的透过率常数JA为0.050-1.939,其中峰1(没食子酸)、峰4(咖啡酸)、峰7(木兰碱)、峰17(小檗碱)和峰18(巴马汀)的JA较大,分别为0.212、0.354、0.163、0.184、0.157。4、开展了双柏喷膜剂与四味中药的经皮渗透特性分析,初步获得中药不同类成分群的经皮渗透特性。(1)不同样品特征峰累积透过率-时间零级方程的相关系数r1基本大于特征峰累积透过率-时间一级方程的相关系数r2,提示在试验皮肤活性较佳的情况下,中药经皮渗透呈现较匀速的状态。(2)双柏喷膜剂蒽醌类成分经皮渗透性能优于大黄醇溶液及含0.1%薄荷脑的大黄醇溶液,表明双柏喷膜剂含有的促透剂对其蒽醌类成分具有优异的促透作用；双柏喷膜剂酚酸类、生物碱类、黄酮类及其他类成分特征峰中,峰1(没食子酸)、峰4(咖啡酸)、峰7(木兰碱)、峰14(槲皮苷)、峰17(小檗碱)和峰18(巴马汀)的经皮渗透性能优于关黄柏、泽兰、侧柏叶醇溶液及含0.1%薄荷脑的相应醇溶液,表明双柏喷膜剂含有的促透剂对蒽醌类、酚酸类、生物碱类、黄酮类及其他类成分具有优异的促透作用,进一步阐明了双柏喷膜剂工艺合理,符合外用药的经皮渗透需要。(3)四味中药的醇溶液中,大黄酚酸类及其他类成分的JA为0.057～0.304,其中峰1(没食子酸)的为0.238,其经皮渗透性能基本优于大黄蒽醌类成分(JA为0.014～0.174)和其他三味中药；关黄柏生物碱类及其他类成分特征峰的JA为0.080～0.176,其中峰4(木兰碱)、峰11(巴马汀)及峰12(小檗碱)的JA分别为0.139、0.147、0.176,其经皮渗透性能优于侧柏叶和泽兰；侧柏叶峰1-7的JA为0.015～0.086,其经皮渗透性能稍优于泽兰,但泽兰的峰2(咖啡酸)的JA为0.137,经皮渗透性能与关黄柏相当。(4)四味中药的水煎液中,大黄酚酸类及其他类成分的经皮渗透性能基本优于蒽醌类成分；在侧柏叶水煎液中,黄酮类及其他类成分的经皮渗透性能与大黄酚酸类及其它类成分相当,其中峰1的JA为0.545,明显要大于其它类成分群的峰；泽兰水煎液的经皮渗透性能稍弱于于侧柏叶水煎液；在关黄柏水煎液中,主要特征峰的JA均JA小于0.080,经皮渗透性能基本弱于其它三味中药。结论：1、优化的大黄、关黄柏、泽兰、侧柏叶HPLC特征图谱分析方法可行,可用于药材质量控制及作为工艺研究的参考；建立的双柏喷膜剂HPLC特征图谱分析方法可行,可兼顾分析不同类型成分群,为制剂的质量标准完善提供了方法依据；双柏喷膜剂中不同类成分群的经皮渗透性能均优于单味药的经皮渗透性能,提示双柏喷膜剂工艺合理。2、中药不同类成分基本能经皮渗透,但经皮渗透性能差异很大