酶联接免疫吸附测定elisa实验指导

酶联接免疫吸附测酶联接免疫吸附测实验前准TNFα的ELISA检测试剂盒为：HumanTumorNecrosisFactorαELISAKit主要仪器和耗材有：ThermoScientific得的各个量程单通道移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头及冰盒等孵育；洗涤；二抗孵育；洗涤；亲和素-HRP孵育；洗涤；底物显色；OD值的检测；标准曲线的绘制与标本中TNFα浓度的计算。样品稀2000pg/ml取8只2000pg/ml取8只1.5m离心管，做好浓度标记，分别是：1000、500、250、125、62.531.2、15.、0pg/ml200l8个离心管中，取200l的标准品母液至第1个离心管中，漩涡混匀后吸取200l至第2个离心管中，同样漩涡混匀后吸取200l至第个离心管中，依次稀释至第7免疫反PlateWashing洗涤酶标板3次，将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。PlateWashing洗涤酶标板3次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。按每孔 PlateWashing洗涤酶标板3次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。100μlTMB30min终止后于波长492nm处立即进行OD值的检吸光值测打开ThermoScientificSkanlt吸光值测打开ThermoScientificSkanltSoftware软件，点击“Newsession”新建程序，给程序命名后，点击“Next”；根据所用的酶标板型号选择微孔板的类型，点击进入填充向导界面；先填充空白对照,“Type”选择Blank，No.ofcalibrators与No.of结果分疑问解温度应控制在样品在使用前未平衡至室温，这会降样品在使用前未平衡至室温，这会降低试剂中有效浓度的发挥，从冰箱中多种，具体实验中要注意各种底物的使用方法以及最大吸收波长等的不同差别，请问doctor，这又是什么原因呢？由于颜色都很深，导致各个组分之间差异很小，结果不可用。考虑以下几并加以改进：首先考虑封闭问题，封闭是ELISA中的可选步骤，仔细阅读说书，以确定是否需要封闭和封闭的具体方法。其次是抗体的稀释比例，适宜的体浓度对最后结果显示差异很关键，根据说明书的推荐比例或进行预实验摸索以确定最佳稀释比例。另外同样需要考虑洗涤情况，洗板次数不够，或浓缩洗稀释倍数不符合要求，洗涤冲击力不够，浸泡时间太短等都会导致非特异性结的残留，从而显色较深。严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，合适的洗涤击力，按要求置留洗涤液时间和洗涤次数。最后还需注意，加入底物后显色时不宜过长，终止液终止后立即进行OD值的检测实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本显色很弱说明实验系统本身正常，一方面考虑：待测标本中可能不含强阳性标本，结果可能是正常的，如有怀疑，可复检。另外考虑，标本中加入了叠氮钠作为腐剂，酶联免疫实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用ProClin系列、柳汞等其他防腐剂用于ELISA检测的血液标本在制备实验样品时、以及加样时需要注意些么这是在临床检测中常见的问题。标本为血清时最好将血液先自然存放1-2h后，再3000rpm15min；标本为血浆时，采血时必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血