分子病毒学课件

一、病毒基因组的结构与功能

绪论

二、病毒基因表达的调控原理三、病毒感染的分子机制四、病毒致癌的分子机理五、抗病毒活性物质六、病毒基因工程疫苗第一节分子病毒学的主要研究内容

一、病毒的发现时期二、病毒的化学时期1、病毒的结晶2、电子显微镜的应用三、病毒研究的细胞水平时期四、分子病毒学的研究时期

第一节病毒的定义第二节病毒的分类和命名一、病毒分类和命名的规则（一）一般规则（二）分类阶元的命名规则（三）种的规则（四）属的规则（五）亚科的规则（六）科的规则（七）目的规则（八）亚病毒感染因子的规则（九）书写规则二、病毒分类原理及其依据（一）病毒分类原理（二）病毒分类的依据1、病毒粒子特性2、病毒抗原性质3、病毒生物学特性（三）病毒种的概念及其分类依据（1）基因组序列的相关性（2）天然的宿主范围（3）细胞和组织的嗜亲性（4）致病和细胞病变特点（5）传播方式（6）生理生化性质（7）抗原特性三、病毒分类系统第三章病毒的结构极其基因组第一节病毒的结构组成一、病毒的包膜（一）病毒包膜的来源（二）病毒包膜的化学组成1、病毒包膜所含有的脂类2、病毒包膜糖蛋白（三）病毒包膜的功能1、病毒吸附2、细胞融合活性3、血溶活性4、抗原性二、病毒的衣壳（一）衣壳的组成（二）衣壳蛋白的功能1、保护病毒基因组2、决定病毒的抗原性3、吸附作用4、血凝作用三、病毒的内含物第二节病毒的形态结构类型一、螺旋对称的病毒壳体二、二十面体对称的病毒壳体三、复合对称的病毒壳体第三节病毒的基因组一、病毒的核酸类型二、病毒核酸的大小及其碱基的组成三、病毒基因组的结构特征（一）DNA病毒基因组1、双链DNA病毒基因组2、单链DNA病毒基因组（二）RNA病毒基因组1、正链RNA病毒基因组2、负链RNA病毒基因组3、双链RNA病毒基因组（三）病毒基因组结构的复杂性1、粘性末端2、末端冗余3循环排列

4、回文结构5、末端反向重复序列

6、重叠基因7、分段基因组8、帽子和poly（A）结构

9、其他结构特征

第四章病毒的吸附、侵入和脱壳第一节病毒的吸附一、病毒的吸附蛋白1、细胞受体结合区2、融合区3、跨膜区4、膜内区二、病毒的细胞受体1、细胞受体单位2、细胞受体位点三、病毒吸附蛋白与细胞受体结合的机制1、可逆性吸附2、不可逆性吸附3、影响病毒吸附的环境因素第二节病毒的侵入一、注射式侵入二、细胞内吞三、膜融合四、直接侵入第三节病毒的脱壳第五章病毒基因组的复制第一节病毒基因组复制的基本特点一、全保留复制和半保留复制二、病毒基因组的复制起始三、病毒基因组的复制方向四、连续复制与不连续复制第二节病毒基因组复制所需的复制酶一、依赖于宿主细胞的复制酶二、病毒基因组自身编码的复制酶1、DNA病毒自身编码的复制酶及其相关蛋白2、RNA病毒自身编码的复制酶三、病毒蛋白与宿主蛋白构成的病毒复制酶第三节病毒基因组的复制与调控一、病毒基因组复制的主要方式1、复制叉方式2、滚环方式3、链置换方式二、dsDNA病毒基因组的复制1、T4噬菌体基因组DNA的复制2、腺病毒基因组DNA的复制3、痘病毒基因组DNA的复制4、乙型肝炎病毒（HBV）基因组DNA的复制5、SV40病毒基因组DNA的复制三、ssDNA病毒基因组的复制1、自主性细小病毒基因组DNA的复制2、依赖性细小病毒基因组DNA的复制四、dsRNA病毒基因组的复制五、+ssRNA病毒基因组的复制

1、脊髓灰质炎病毒基因组的复制2、+ssRNA噬菌体基因组的复制六、-ssRNA病毒基因组的复制七、病毒基因组DNA复制的调控1、174DNA复制的调控2、噬菌体DNA复制的调控3、SV40DNA复制的调控4、腺病毒DNA复制的调控

病毒基因病毒包括mRNA转录和蛋白质翻译两个不同的过程。首先以病毒基因组核酸（DNA或RNA）为膜板，在病毒或宿主特异性RNA聚合酶的作用下，依照碱基配对互补的原则，转录生成病毒mRNA，然后这些转录生成的mRNA携带病毒的基因信息，进入宿主细胞的核搪体上，再经过翻译，合成病毒蛋白外，还有病毒基因组复制、转录所需的酶如复制酶、转录酶，，以及一种或几种调节蛋白，有包膜的病毒直至合成包膜糖蛋白。第六章病毒的基因表达

由于病毒缺少编码核糖体的遗传信息，因而其蛋白质翻译完全依赖宿主的翻译体系，但病毒RNA通过同宿主细胞核糖体结合，可以改变宿主核糖体的合成路线，使之合成病毒蛋白而不在合成细胞蛋白。第一节病毒基因转录和转录后加工一、病毒基因转录的特点（一）病毒的早期转录和晚期转录

病毒基因转录有先后之分，即按不同时序进行转录的，这是病毒基因表达的重要特点之一。病毒的早期转录一般发生在病毒感染初期，其早期基因主要编码合成与病毒基因组复制以及晚期基因表达相关的酶和蛋白质；而病毒的晚期转录则出现在病毒基因组复制之后，其晚期基因主要编码合成病毒结构蛋白如衣壳蛋白、包膜糖蛋白等。

腺病毒基因组DNA进入宿主细胞核后，首先启动早期转录，然后进行中期和晚期转录。在腺病毒的dsDNA中，3’-5’链称为γ链，转录方向从左到右；5’-3’链称为l，转录方向从右到左，早期转录除了出现在l链上外，也出现在γ链上，如早期基因区E1A、E1B和E3在γ链上转录，E2A、E2B和E4在l链上转录；晚期转录如L1、L2、L3、L4、L5基因区的转录均发生在γ链上。1、腺病毒的早期转录

E3基因区在76.6~86.2mu之间，其启动子在76.6mu处，该区至少转录6种mRNAs，它们分别编码14KD、14.7KD、11KD、10KD、16KD和19KD蛋白。虽然E3并非是病毒生长和复制所必须的，在缺少大部分或全部E3区的情况下，Ad仍能在组织培养上繁殖，但一些证据表明，E3区编码的19KD糖蛋白能够结合位于内质网中的MHC多肽的重链，并且阻止MHC进一步转移到细胞表面，从而降低细胞毒性T淋巴细胞对Ad感染靶细胞的识别。2、腺病毒的晚期转录

所谓非对称性转录是指病毒基因的转录并不固定在一条DNA链上，其中一些基因从一条链上转录，而另一些基因从另一条链上转录，因而使转录方向有左向和右向或者顺时针和逆时针的区别。（二）病毒的非对称性转录（三）病毒的多基因转录和单基因转录

所谓多基因转录是指多个基因联合转录在一条链上，这样的mRNA也称为多顺反子（polycistroicmRNA）；单基因转录是指一个基因单独转录在一条mRNA链上，这样的mRNA也称为单顺反子mRNA（polycistroicmRNA）。（四）病毒转录方式的差异

由于病毒基因组具有线状或环状，单链或双链，正链或负链区分，因而mRNA的转录方式也各有不同。对于dsDNA病毒来说，它们能以任意一条链为模板转录出mRNA；ssDNA病毒则必需以其单链为模板，首先复制形成另一条链子代DNA链，再由二者结合形成dsDNA后，才能从其中任意一条链上转录合成mRNA；对于+ssRNA病毒而言，其基因组+ssRNA或者直接作为mRNA，或者先复制一条与亲本+ssRNA互补的-ssRNA，再以-ssRNA为模板转录产生mRNA；然而-ssRNA病毒可以直接以-ssRNA为模板合成mRNA；dsRNA病毒则是以其中的负链RNA为模板进行全保留转录而合成mRNA；逆转录病毒比较特殊，其+ssRNA基因组在逆转录酶的催化下合成一条cDNA链，再以cDNA链为模板复制出另一条DNA链，由两条DNA结合形成原病毒dsDNA，然后原病毒dsDNA整合到宿主细胞染色体DNA上，以整合的原病毒dsDNA作为模板转录合成Mrna。

二、病毒基因转录所需要的转录酶

（一）病毒利用宿主的RNA聚合酶（二）病毒粒子携带的转录酶（三）病毒在复制循环中自身编码的转录酶（四）病毒蛋白和宿主蛋白共同构成的转录酶三、病毒基因的转录启动子与转录起始

一些DNA病毒的基因转录除了需要RNA聚合酶和适宜的模板外，其基因组DNA上也有类似于原核生物和真核生物的转录启动子和转录起始位点，真核DNA病毒甚至还含有增强子序列，这些特定的调控元件直接参与了病毒基因转录的起始和转录调控。真核-ssRNA病毒如副粘病毒、弹状病毒的基因组虽然没有转录启动子，但其转录起始与先导序列区以及基因接头区的特定核苷酸序列有关。（一）DNA噬菌体基因转录的启动子1、-10区在距离转录起始位点第一个核甘酸的上游-13~-4位碱基处有一段序列叫做Pribnowbox，即-10区，典型的Pribnowbox

的保守序列为TARAAT，其中第6个碱基全是T，故称为保守T，由于-10区富含AT序列，因而易于变性和解链。2、-35区-35区位于Pribnowbox左侧，其共同序列为TTGACA。（二）真核DNA病毒基因转录的启动子与增强子1、TATAbox真核DNA病毒与真核生物一样，在基因转录起始位点的上游有一个保守的启动子序列，它有TATAA（T）AA（T）组成，称为~，又叫Hognessbox或Goldberg-Hognessbox，其位置不在-10区，而在-30区~-20区。TATAbox靠近转录起始位点，主要参与病毒mRNA转录起始点的选择，与转录起始的精确性有关。如果TATA区出现碱基缺失或突变，都会对转录产生严重影响，如在腺病毒晚期启动子TATA区，出现含有TATA序列的-47~-21区缺失，其晚期基因完全不能转录，而且即使G或A替代启动子TATAbox中的第三个碱基T形成TAGA或TAAA，也会引起基因转录下降。2、CAATbox和GCbox真核DNA病毒在转录起始位点上游-110~-40区还有另外两种启动子序列，一个启动子序列为GGC（T）CAAT（A），其中CAAT序列相当保守，故称CAATbox；另一个启动子序列为CCGCCC或GGCGGG，称为GCbox。HSVtk基因在TATAbox的上游有一个CAATbox和2个GCbox，HSVa4基因没有CAATbox，但有5个GCbox。

CAATbox和GCbox虽然不参与转录起始点的确定，但一些细胞转录因子如NF1与CAATbox结合，SP1与GCbox结合，可以促进RNA聚合酶II的转录，提高病毒基因转录的效率。3、增强子是指能使与它连锁的上游或下游基因转录频率明显增强的DNA序列。在SV40基因组中首次发现了增强子，它位于SV40早期基因上游-250~-107bp，含有两个正向重复序列，每个长度为72bp，其核心序列为GGTGTGGAAAG。具有如下特点：（1）转录增强效应明显，增强子一般能使基因转录频率增加10~200倍，有的可以增加上千倍。（2）增强效应与位置和取向无关，不论增强子是在基因的上游或下游，均表现出增强效应。（3）增强子一般为重复序列，长度在50bp以上，通过特定的转录基因与其结合，可增进转录作用。（4）增强效应有严格的组织和细胞特异性，但对其所作用的基因无专一性。（5）有的病毒增强子还受外部信号的调控，如小鼠乳腺瘤病毒启动子的上游大约-100bp处，有一个增强子序列，它是固醇类激素与其受体蛋白所形成的复合物结合到该增强子序列上之后，不仅能促进下游基因的转录，而且还能促进上游基因的转录。4、帽子位点存在于启动子的下游，它是真核DNA病毒mRNA的转录起始位点，病毒基因转录模板链上帽子位点的碱基一般为T，这样mRNA掺入的第一核苷酸就是ATP。（三）病毒的转录起始

宿主RNA聚合酶或病毒编码的RNA聚合酶对病毒基因启动子的识别和特异性结合，是转录起始的关键步骤。就是T4、T7噬菌体的早期转录而言，细菌RNA聚合酶全酶中的亚基负责识别和寻找早期转录启动子，它与RNA聚合酶全酶特异性地结合这些基因的转录启动子，以及进行精确的转录起始有关……显然核心酶催化的转录起始是随机的。四、病毒的转录终止（一）转录终止子

目前在噬菌体DNA模板链上发现有转录终止位点，即终止子，这些终止子具有共同的结构特征：其终止子上游存在有反向重复序列，该序列富含GC碱基对，由此段DNA转录产生的RNA易于形成发夹结构，在终止点的下游有一段由48个A组成的序列，因而转录产物的3’端带有寡聚U，这两种结构特征的存在决定了转录终止，当新生RNA出现发夹结构时，会导致RNA聚合酶暂停，破坏RNA-DNA杂喝链的正常结构；而寡聚A的存在又能使杂合链中的RNA3’端产生不稳定的A：U区域；结果二者共同作用导致RNA从DNA模板链上解离下来。

转录终止子有两种类型：一类是不依赖于蛋白辅助因子，即ρ因子的终止子；另一类是依赖于ρ因子的终止子从图可知不依赖ρ因子的终止子在结构上除了茎的长度不同外，都有富含GC区，而且茎-环结构之后都带有一个ploy（U）区；而依赖于ρ因子的终止子既缺少富含GC区，也无ploy（U）尾。1、不依赖ρ因子的转录终止

2、依赖ρ因子的转录终止（二）抗转录终止作用

五、病毒的转录后加工和拼接

通常噬菌体mRNA5’端缺少帽子，3’端也无poly（A）尾，其合成的mRNA大多不需要加工，一经转录就可以直接翻译合成病毒蛋白，但某些DNA噬菌体的基因转录产生的多顺反子mRNA，需要经过核酸内切酶切割成较小的片段，才能进行翻译。真核DNA病毒转录的mRNA大都需要在5’端戴帽和3’端加尾，除此而外，转录初产物还需要先切除内含子，再进行拼接，最后才形成成熟的Mrna。（一）病毒mRNA5’端的戴帽

大多数真核病毒mRNA的5’端都有以5’-5’结合的7甲基化鸟苷酸残基封闭的结构，称为帽子0如果在原mRNA第一个核苷酸2’-O位上继续产生甲基化，则形成帽子1，第二个核苷酸2’-O位上甲基化，构成帽子2。真核病毒mRNA5’帽子有以下功能（1）帽子结构作为核糖体识别mRNA的信号；（2）帽子结构增加了病毒mRNA的稳定性，使之棉遭宿主细胞核酸酶的攻击。（3）帽子结构能被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进病毒蛋白的合成。（二）病毒mRNA3’端加ploy（A）尾

几乎所有研究过的动物病毒的mRNA3’端都有ploy（A）尾，长度一般短于真核细胞mRNA3’端的ploy（A）尾。目前已经发现在ploy（A）位点上游的10~25个核苷酸处都存在有加尾识别信号序列AAUAAA，其内切酶能够识别AAUAAA序列。病毒mRNA的ploy（A）尾主要与其在细胞质中的稳定性有关，一般而言，ploy（A）短的mRNA半衰期也短，ploy（A）长的mRNA则半衰期也长。（三）病毒mRNA前体的拼接

在病毒内含子两端也有类似于真核生物结构基因的拼接供体和受体信号，即5’！GU……AG！3’，通过宿主细胞的拼接体系识别该信号，可以促进病毒mRNA前体的拼接。在这里5’GU和3’端AG信号对mRNA前体的拼接是十分重要的。

一些研究还证实内含子的内部序列也可以影响mRNA前体的拼接效率Khoury曾分离得到SV40早期基因T缺失的突变株，这些缺失发生在早期基因的内含子中，虽然它们并未涉及到拼接信号，但其早期的初转录产物与野生型SV40相比，经过切割和拼接产生的成熟mRNA以及翻译合成T抗原的量都大为减少，究其原因可能是由于宿主拼接酶系的作用还要求mRNA前体有特定的二级或三级空间构型的缘故，而维持这种空间构型则需要有内含子序列的存在。在真核细胞中存在多种丰富的小分子叫做核内小RNA（smallnuclearRNA，snRNA），其中参与mRNA前体拼接的主要有U1、U2、U4、U5和U6snRNA，这些snRNA经常与核内的几种蛋白质结合形成核内小核糖核蛋白（smallnuclearribonuleoprotein，snRNA），并与mRNA前体共同组成一个拼接体（spliceosome）

从上述可以看出，病毒mRNA前体的拼接既受控于宿主细胞的拼接系统，也需要有病毒自身编码的调节蛋白以及转录产生的“拼接RNA”起作用。第二节病毒蛋白的翻译及其翻译后加工

病毒mRNA翻译合成蛋白质的过程是在核糖体上进行的，其核糖体完全由宿主细胞的组分构成，没有任何病毒组分的参与，因此病毒类似于宿主细胞mRNA的翻译过程，而病毒蛋白产物的翻译后加工则不尽相同。一、核糖体对病毒mRNA起始密码子的识别与翻译起始

真核生物核糖体40S亚基上的18SrRNA3’端虽然没有原核生物16SrRNA那样的CUCCA序列，而且真核生物和真核病毒mRNA5’也没有SD序列，但其mRNA5’端的帽子结构可作为核糖体40S亚基以及起始因子eIF3、eIF4B、eIF4F、eIF4A的识别和结合信号。一些研究还发现，真核病毒mRNA除了5’端帽子结构与病毒蛋白合成起始有关外，在起始密码子子AUG附近可能亦存在与18rRNA3’末端互补的序列。大多数噬菌体和真核病毒蛋白翻译是从mRNA上的起始密码子AUG起始的，但副粘病毒PORFmRNA上的AUG、GUG和ACG均可作为起始密码子，翻译合成不同的蛋白质。

二、病毒蛋白的翻译后加工（一）病毒蛋白前体的切割（二）病毒蛋白的化学修饰

有些病毒蛋白在宿主细胞核糖体上合成后，需要经过切割和共价修饰，即进行翻译后加工，才能形成成熟而有功能的蛋白质，如一些病毒多蛋白前体的切割，糖基化和磷酸化修饰等其修饰作用包括磷酸化、甲基化和脂酰化等。1、病毒蛋白的磷酸化

宿主或病毒编码的蛋白激酶能将ATP末端的磷酸基团转移到病毒蛋白的Ser，Thr和Tyr残基上，使之形成磷酸化蛋白，磷酸化是蛋白质翻译后广泛存在的一种化学修饰，是控制酶活性的重要步骤。2、病毒蛋白的糖基化

一些动物病毒的包膜蛋白在翻译后产生糖基化，形成糖蛋白突起，它与病毒粒子的吸附和侵入有关。通常这些寡糖经过N-或O-糖基化连接于Asn、Ser和Thr残基上，糖基化作用往往发生在内质网和高尔基体中。

干扰素第一节干扰素基因及其编码的蛋白质一、I型干扰素基因和蛋白产物二、II型干扰素基因和蛋白产物第二节干扰素的诱导合成一、I型干扰素的合成二、II干扰素的合成第三节干扰素受体及信号传递途径一、干扰素受体二、干扰素的信号传递途径第四节干扰素诱导的抗病毒作用一、2-5（A）合成酶和RNaseL途径二、dsRNA依赖性蛋白激酶途径三、Mx蛋白的抗抗病毒机制四、其他干扰素诱导蛋白的抗病毒作用第五节病毒抗干扰素作用的对策第十一章噬菌体分子生物学第一节噬菌体的结构组成一、有尾噬菌体的结构（一）壳体组成1.头部2.尾部

（二）有尾噬菌体的核心1.T偶数噬菌体核心2.λ噬菌体核心3.其他有尾噬菌体的核心二、球部噬菌体的结构（一）壳体结构（二）球形噬菌体的核心三、丝状噬菌体的结构第二节噬菌体基因组的结构一、DNA噬菌体基因组（一）dsDNA噬菌体基因组1.Λ噬菌体基因组的结构

2.T4噬菌体基因组的结构（二）ssDNA噬菌体基因组1.

φX174噬菌体基因组的结构2.M13噬菌体基因组的结构二、RNA噬菌体基因组第三节噬菌体基因组的复制一、DNA噬菌体基因组的复制（一）dsDNA噬菌体基因组的复制1.λ噬菌体DNA复制2.T7噬菌体DNA复制（二）ssDNA噬菌体基因组的复制1.以亲代环状+ssDNA分子为膜板合成互补的负链2.子代+ssDNA的合成二、RNA噬菌体基因组的复制第四节噬菌体基因组转录与翻译的调控一、噬菌体基因组转录的调控1.λ噬菌体的转录的调控2.T7噬菌体的转录调控3.其他噬菌体的转录调控二、噬菌体翻译的调控1.反义RNA在λ噬菌体基因Q翻译中的调控作用2.R17噬菌体RNA二级结构对翻译的调节

第五节噬菌体溶原性感染一、噬菌体溶原化状态的建立二、噬菌体基因组的整合三、原噬菌体的割离四、转导1.普遍性转导2.局限性转导第六节基因克隆的噬菌体载体一、λ载体（一）酶切位点的去除与再建1.EcoRI位点的去除2.λ同类噬菌体的重组3.酶切位点的再建（二）遗传标记与λ载体的重组（三）Spi重组体的筛选（四）chi位点的引入（五）表达载体的构建二、粘粒载体三、M13载体第十二章动物病毒分子生物学第一节动物dsDNA病毒一、嗜肝DNA病毒科（一）病毒粒子的结构（二）病毒基因组及其编码蛋白（三）病毒的复制与转录（四）病毒粒子的组装与释放1.20nm空心颗粒的组装2.Dane颗粒的组装与释放（五）嗜肝DNA病毒与肝细胞癌二、痘病毒科（一）病毒粒子的结构及其化学组成（二）病毒基因组极其编码蛋白（三）病毒粒子所包含的多肽和酶（四）病毒的侵入与脱壳1.病毒的侵入2.病毒粒子的脱壳（五）病毒的基因表达1.早期转录2.中期转录3.晚期转录（六）病毒粒子的组装与释放（七）痘苗病毒作为外源基因表达的载体

第二节动物ssDNA病毒一、细小病毒基因组及其编码产物二、细小病毒的复制与转录（一）自主细小病毒（二）依赖细小病毒三、AAV作为基因克隆的载体四、AAV与抑癌作用

第三节动物dsRNA病毒一、呼肠孤病毒粒子的结构二、呼肠孤病毒的基因组三、呼肠孤病毒编码的蛋白质及其功能（一）病毒结构蛋白（二）病毒非结构蛋白四、呼肠孤病毒的复制（一）病毒的侵入（二）病毒的转录与复制（三）病毒粒子的组装与释放第四节动物-ssRNA病毒一、正粘病毒科（一）流感病毒粒子的结构（二）流感病毒的基因组及其编码蛋白1.P基因与P蛋白2.NP基因与NP蛋白3.HA基因和HA蛋白4.NA基因与NA蛋白5.RNA7基因及其编码产物6.RNA8基因与NS1、NS2蛋白（三）流感病毒复制与基因表达的调控1.流感病毒粒子的侵入与脱壳2.流感病毒的mRNA转录3.流感病毒基因组的复制4.流感病毒基因表达的调控（四）流感病毒粒子的组装与释放二、副粘病毒科（一）副粘病毒粒子的结构（二）副粘病毒基因组及其编码产物1.NP蛋白2.P蛋白3.C蛋白4.V蛋白5.L蛋白6.M蛋白7.病毒包膜糖蛋白8.肺病毒的NS1和NS2蛋白（三）副粘病毒基因组的转录与复制三、弹状病毒科（一）弹状病毒粒子的结构1.病毒包膜2.核衣壳（二）弹状病毒基因组的结构（三）弹状病毒的转录与复制1.病毒吸附、侵入和脱壳2.病毒基因组转录3.病毒基因组复制4.病毒粒子的组装与出芽四、布尼亚病毒科（一）布尼亚病毒粒子的结构（二）布尼亚病毒的基因组及其编码蛋白1.SRNA节段的编码产物2.MRNA节段的编码产物3.LRNA节段的编码产物（三）布尼亚病毒的转录与复制1.布尼亚病毒的转录2.布尼亚病毒的基因组复制五、沙粒病毒科（一）沙粒病毒粒子的结构（二）沙粒病毒的基因组及其编码蛋白（三）沙粒病毒的转录与复制（四）沙粒病毒的DI颗粒和DIRNA第五节动物+ssRNA病毒一、小RNA病毒科（一）小RNA病毒粒子的结构（二）小RNA病毒的基因组（三）小RNA病毒的复制机制1.小RNA病毒的基本复制周期2.小RNA病毒的吸附、侵入和脱壳的机制3.多蛋白的合成与切割4.小RNA病毒基因组复制（四）小RNA病毒粒子的形态发生二、冠状病毒科（一）冠状病毒粒子的结构与结构蛋白图1-1冠状病毒粒子的结构模式图（动物病毒学殷震）Fig.1-1.ModelofCoronavirusParticle（二）冠状病毒基因组结构图1-2.冠状病毒基因组示意图（分子病毒学徐耀先）Fig.1-2.ModelofCoronavirusGenome（三）冠状病毒的复制机制1.冠状病毒的感染2.冠状病毒的转录与复制3.冠状病毒mRNA的表达4.冠状病毒结构蛋白的翻译后加工（四）冠状病毒粒子的出芽与翻译三、披膜病毒科（一）披膜病毒粒子的结构（二）披膜病毒基因组的结构图1-4.冠状病毒的复制模式（分子病毒学徐耀先）Fig.1-4ModelofCoronavirusReplication图1-3亚基因mRNA的转录模式（分子病毒学徐耀先）Fig.1-3ModelofsubgenomicmRNATranscriptionORF1SORF3sMMNORF7UTRLeadersequcencePoly(A)CUAAACEncodedfragmentt+mRNA5’—mRNA3’12S34sM5M6N7图.1-7冠状基因组结构及表达模式图Fig.1-7Outlineofstructureandexpressionof（三）披膜病毒的复制与基因表达1.甲病毒的复制和基因表达2.风疹病毒的复制（四）披膜病毒的DI颗粒四、黄病毒科（一）病毒粒子的结构（二）病毒基因组的结构及其编码蛋白（三）病毒基因组的复制第十三章肿瘤病毒分子生物学与癌基因第一节DNA肿瘤病毒一、腺病毒（一）腺病毒粒子的结构（二）腺病毒的复制循环（三）腺病毒引起细胞转化的分子机制1.腺病毒转化作用的基因片段2.腺病毒的转化基因E1A和E1B及其编码产物3.E1A和EIB蛋白的调节功能及其转化活性二、多瘤病毒（一）病毒粒子的结构（二）病毒基因组（三）病毒增殖性感染1.病毒的侵入2.早期基因表达3.晚期基因表达4.病毒粒子组装和宿主细胞裂解（四）病毒基因表达的调控1.早期基因表达调控区2.晚期基因表达调控区3.增强子4.复制原点（五）SV40与小鼠多瘤病毒的转化作用1.病毒转化基因的发现2.病毒转化蛋白的致癌机理三、乳头瘤病毒（一）HPV型别与不同类型肿瘤1.皮肤疣与皮肤癌2.生殖道疣和生殖道癌3.口腔与呼吸道肿瘤（二）乳头瘤病毒粒子结构（三）乳头瘤病毒基因组结构（四）乳头瘤病毒的基因表达1.早期基因表达2.晚期基因表达（五）乳头瘤病毒的癌基因及其转化作用机制四、疱疹病毒（一）疱疹病毒粒子的结构（二）疱疹病毒基因组结构及其功能1.病毒基因组的异构体2.疱疹病毒的基因组3.病毒基因及其编码产物（1）立即早期基因及其蛋白产物（2）早期基因及其蛋白产物（3）晚期基因及其编码产物（4）病毒潜伏感染期表达的基因和蛋白产物1）EBNA基因家族2）LMP基因3）EBERs基因4.病毒基因组的调空区（三）疱疹病毒的基因表达与基因组复制1.病毒的基因表达2.病毒的基因组复制（四）疱疹病毒的细胞转化及其致癌作用1.EBV的癌基因2.EBV癌基因的转化作用3.ESV与肿瘤（1）EBV与鼻烟癌（2）EBV与BL（3）EBV与其他肿瘤第二节RNA肿瘤病毒——逆转录病毒一、RNA肿瘤病毒的分类地位（一）α逆转录病毒（二）β逆转录病毒属（三）γ逆转录病毒属（四）δ逆转录病毒属（五）ε逆转录病毒属二、病毒粒子的结构三、病毒的基因组A型颗粒B型颗粒C型颗粒（一）基因组编码区1.Gag基因⒉.pol基因3.pol基因4.env基因（二）基因组的末端结构1.R序列2.U5序列3.PB位点4.先导序列5.PP序列6.U3序列四、病毒的结构蛋白1.包膜蛋白2.核心蛋白3.酶五、病毒的基因组复制与基因表达（一）基因组RNA的逆转录和原病毒DNA合成（二）原病毒DNA的整合（三）病毒基因的表达1.病毒基因的转录2.转录后加工3.病毒mRNA的翻译六、逆转录病毒的致癌作用与癌基因（一）病毒癌基因及其致癌机制1.Src与abl癌基因2.Sis癌基因3.erbB和fims癌基因4.Ras癌基因家族5.Myc癌基因及其核癌基因6.Mos与raf癌基因（二）原病毒DNA插入和整合对细胞癌基因的顺式激活（三）HTLV-1调节蛋白P40tax的反式激活作用第三节人类免疫缺陷病毒的分子生物学一、HIV基因组结构的复制性（一）结构基因1.Gag基因2.pol基因3.env基因（二）附加基因与调节基因1.Vif基因2.vpr基因3.tat基因4.rev基因5.Nef基因6.vpu基因7.vpx基因二、HIV基因表达的调控（一）LTR中的转录启动子（二）增强子（三）Tat和Rev蛋白及其效应元件对HIV基因表达的影响三、HIV感染的分子基础（一）CD4与HIV的嗜亲性（二）gp120与CD4分子在HIV吸附过程中的相互作用（三）gp120的V3环对HIV感染的影响四、HIV潜伏感染与激活五、AIDS的发生机理（一）细胞素与AIDS（二）T4细胞耗竭（三）自身免疫与B细胞激活六、抗HIV治疗及其疫苗的展望（一）阻断病毒吸附和建立感染（二）病毒逆转录和蛋白酶活性的抑制（三）HIV疫苗的研制第十四章亚病毒分子生物学第一节类病毒1.马铃薯纺锤形块茎类病毒科2.鳄梨白斑类病毒科一、类病毒的分子结构（一）T结构区（二）P结构区（三）C结构区（四）结构区二、类病毒的结构转换三、类病毒的复制和剪接第二节卫星RNA和卫星病毒一、卫星RNA和卫星病毒的分类1.A型卫星2.B型卫星3.C型卫星4.D型卫星二、卫星RNA和拟病毒三、卫星病毒第三节朊病毒一、朊病毒病二、朊病毒蛋白及其结构型转变三、PrP基因与朊病毒蛋白的合成四、朊病毒的复制第四节丁型肝炎病毒一、HDV病毒粒子的结构二、HDV的基因组三、HDV的转录、复制与翻译四、HDV病毒粒子的组装和释放基因的克隆与表达

基因克隆(genecloning)基因表达(geneexpression)-原核基因表达

-真核基因表达基因克隆

GeneCloning概述克隆载体受体细胞体外重组的策略基因克隆工作流程一、概述确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件：

限制性内切酶连接酶载体受体细胞基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。

基因克隆的核心-----体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。

基因克隆的技术路线

目的基因载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA二、克隆载体复制基因(replicator)选择性记号克隆位点三、受体细胞1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、要求：易于接纳外源DNA

无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性四、体外重组的策略1、粘末端连接1）全同源粘末端连接最方便简单高背景-载体自身环化双向插入2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略粘-粘连接：最有效、最快捷粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平2、平末端连接：酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA效率低，酶用量大3、人工接头连接人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段4、T-A克隆T-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的获得1、直接分离3、构建cDNA文库4、PCR5、人工合成6、差异显示1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库2、构建基因组文库，筛选目的基因基因组文库(genelibrary)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况3、构建cDNA文库，筛选目的基因cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选4、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法5、人工合成较短的DNA6、差异显示法(differentialdisplay,DD)—筛选差异表达的基因（二）体外重组连接体系的建立：温度：粘末端连接：12-18℃

平末端连接：室温（低于30℃)DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3酶量：平端连接时需加大酶量（三）转化—Cacl2法、电击法（四）重组子的筛选及鉴定1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）原位杂交2、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR方向鉴定：联合酶切测序基因的表达

GeneExpression一．表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。

据受体细胞的不同可分为：1．原核表达系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。二．原核生物基因结构和表达特点原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。

3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统

4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位

原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。包括：调控区(调节基因，启动基因，操作基因)、结构基因5、原核生物中参与转录的基因结构：启动子终止子

启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。

一般长40-60bp，富含A-T碱基对具有保守序列：

-10区（pribnowbox）：TATAAT-35区：

RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录各种启动子启动转录能力不同。启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列

终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点转译起始密码子AUG

或GUGSD顺序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp长约3-9bpmRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列

三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：删除内含子和5’非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解

四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。

常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。2、基因剂量：3、核糖体结合位点：SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。AUG—SD间距离。AUG后的核苷酸

五．原核表达载体：

适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子

SD顺序筛选标志其它调控基因

类型：融合型表达载体：----融合蛋白非融合型表达载体：---天然完整蛋白分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙

（一）融合型表达载体

PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因技术关键：克隆基因插入原核序列3’端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点加人工合成的DNA接头构建位相载体----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA载体部分序列DNA序列位相载体----含有3种读码框的系列载体优点：表达效率高产物稳定

易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相载体融合型载体----pGEX系列（二）非融合型表达载体

PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元件：强启动子

SD：

ATG：第一个密码子非融合型表达载体----pPL-LamdaPL启动子---温度诱导插入位点--HpaI（三）分泌型表达载体：1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。

分泌型表达载体----pINIII-ompA1分泌型融合表达载体----pEZZ18六．提高表达水平的手段1、选择合适载体，提高翻译水平强启动子----提高转录水平核糖体结合位点（ATG---SD）避免产物降解：分泌/融合表达细菌蛋白酶抑制剂2、选择合适宿主

Lac启动子----LacI菌PL/PR--------CI857

溶源菌

3、诱导表达温度诱导------PLPR/IPTG的化学诱导----Plac、Ptac

4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解七．表达产物的检测：

1、特异性鉴定：荧光抗体法免疫沉淀法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定

八、原核表达系统的缺点1、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工真核表达系统的必要性及优势1.

具转录后加工系统2.

具翻译后修饰系统3.

可实现真正的分泌表达4.基因治疗真核基因结构及表达调控特点（一）真核基因组的复杂性真核基因组庞大，具大量非编码序列---mRNA丰度不同结构复杂：染色质、核膜、线粒体---表达调控多样不连续性：内含子、外显子没有操纵子结构(二）真核表达系统组成：真核表达载体受体细胞基因转移方式据受体细胞及表达载体的不同分为3种：酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统（三）转化1、原生质体法：去除厚壁2、电穿孔法：效率较高（四）外源基因的表达1、胞内表达2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列（五）缺点不能实现全部的翻译后修饰功能

基因工程

所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合。然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞，使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程（geneengineering）也称为遗传工程（geneticengineering）、基因操作（genemanipulation）、ＤＮＡ重组技术（recombinationDNAtechniques）。有时人们还称它为基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloning）。

遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备，载体的选择，体外ＤＮＡ重组，重组ＤＮＡ引入受体细胞，克隆转化子的筛选，重组ＤＮＡ的检测等。

第一节

基因工程的酶学基础一、限制性核酸内切酸（restrictionendonuclease）：这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶（

restrictionenzyme）。限制性内切酶本来是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：

Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。Ⅱ型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。Ⅲ型酶：这类酶可识别特定顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。

同裂酶（isoschizomers)：

指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂、酶对甲基化位点的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）：

指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于Escheriacoli

RY13的第一个限制酶。二、末端转移酶（terminaltransferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反应与DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。

平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A三、ＤＮＡ连接酶（DNAligase）

该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。

DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。

四、反转录酶（reversetranscriptase）

这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。五、DNApolI及Klenow片段

该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的ＤＮＡ探针，探针的制备方法是采用所谓的缺口平移（nicktranslation）法制备的。

该酶还用于裂口（gap）修补、反转录第二条链的合成（

Klenow）、隐蔽末端的填平反应（

Klenow）等。Klenow片段：DNApolI用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片段，小片段（36KD）具有5’3’

核酸外切酶活性，大片段（76KD）称为Klenow片段，具有DNA链聚合及3’5’核酸外切酶的活性。

六、S1核酸酶：

来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。七、碱性磷酸酶：

来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷反应。

第二节

目的基因的制备一、化学合成法：

1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。

在体外，可以合成一系列长约几百ｂｐ的寡聚核苷酸链，然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸链连接起来。

化学合成的不足之处在于：（１）要已知基因的核苷酸顺序；（２）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（３）价格昂贵。

化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。同时，所合成的基因不含内含子。在原核生物中由于不能进行内含子剪接，所以一旦将含有内含子的基因引入原核生物中表达，其产物往往是没有活性的。

由于化学合成法有上述一些优缺点，所以这种方法较多地用于合成一些比较小的基因，如某些激素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰岛素基因，生长激素释放抑制激素基因等。

由于技术的进步，目前已极少利用化学合成法制备目的基因，而是利用DNA的化学合成法合成一些短的DNA片段作为探针（probe）或PCR的引物。

二、从cDNA文库或基因组文库中分离

cDNA文库及基因组文库的构造我们将在后面讨论，如果制备好了cDNA文库或基因组文库，那么用原位杂交法来筛选（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。将这一克隆子大量繁殖，提取ＤＮＡ，便可获得所需的目的基因。

必要的时候还可以建立差示文库（differentiallibrary）。三、ＰＣＲ法：

PCR（polymerasechainreaction)技术是Mullis于1986年发明的一项体外快速大量扩增ＤＮＡ片段的方法（获1994年诺贝尔奖）。其基本原理就是在体外模拟体内DNA复制的过程，在反应系统中加入欲被扩增的DNA片段，作为模板；人工合成的寡聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq）以及四种核苷酸三磷酸。反应时，先加热至约92℃，使模板变性。降温至约50℃使引物与模板结合（退火），加温至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ链延伸。重复92℃（变性）、50℃（复性）、72℃（延伸）的过程使ＤＮＡ片段得到不断的扩增，可以重复几十个周期。ＤＮＡ片段将2n（ｎ为反应周期数）的倍数增加。四、mRNA差别显示分离目的基因

根据表达特征，真核细胞的基因可以分为两类：一是所谓的看家基因（house-keepinggene），另一类是发育调控基因（developmentalregulatedgene）。

在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differentialexpression）。mRNA的差别显示技术就是用来分离这些差别表达的基因的一项有用的技术。

该技术是P.Liang&A.D.Pardee1992年建立的，全称为mRNA差别显示PCR(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)原理：该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，polyA尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增，可获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5’随机引物。第三节

基因工程载体

载体（ｖｅｃｔｏｒ）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：

分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。

一、质粒（plasmid）载体

质粒是一种独立于染色体外的小分子环状ＤＮＡ，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。

作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）pUC系列：

是目前最常用的E.coli质粒载体。包括pUC7、

pUC8、

pUC9、

pUC12、

pUC13、

pUC18、

pUC19、pUC118、pUC119等。优点：分子量更小，拷贝数更高：分子量在3KB左右，拷贝数可达每细胞500~700个，因此不需要氯酶素扩增。引入多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）方便操作。引入lacZ’基因方便筛选。筛选原理——α互补——兰白筛选：

LacZ’是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。

具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培养基上会形成的兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。

IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。原核表达载体：pGEM系列包括pGEM-3、

pGEM-3Z、

pGEM-3Zf（-）、

pGEM-4、

pGEM-4Z等。带有噬菌体编码的RNA聚合酶启动子SP6及T7启动子，可用于外源基因的表达。pGEX系列：

包括pGEX-1、

pGEX-1λT、

pGEX-2T、

pGEX-3X等。该系列是一类融合表达载体，在克隆位点上游有一个谷胱甘肽巯基转移酶（glutathioneS-transferase，GST）基因的一个片段。融合位点上有特异蛋白酶水解位点，方便GST的去除。在GST上游有一个启动子Ptac（trp操纵子启动子与lac操纵子启动子的融合启动子），在IPTG诱导下表达。二、噬菌体（bacteriumphage,phage）载体：1、λ噬菌体载体：λ噬菌体的基因组结构：AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS

头部基因

尾部基因

功能不明区

溶原化

重组

早期控制

阻遏

DNA合成

溶菌生长非必须区段cI基因：溶原过程控制基因，插入式载体：λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。

由于λ噬菌体包装时，只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，所以插入式载体可携带的外源ＤＮＡ片段较取代式为小。

cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A取代式载体：野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon4A、

λEMBL3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。

Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40（左右臂连接）

（三段自身连接）

（插入片段）

为避免载体自身连接产生的假阳性，可采用双酶解的方法。例如：