多西环素在斑点叉尾鮰中安全使用及快速检测技术研究

多西环素在斑点叉尾鮰中安全使用及快速检测技术研究本论文从多西环素(DOTC)对斑点叉尾鮰的安全性、比较药动学、新剂型、药动-药效结合模型及快速检测技术等几个方面开展研究,其目的是解决DOTC在斑点叉尾鮰中安全合理使用与残留控制的问题。1.研究了不同浓度(87.5、175、350mg/kg)多西环素口灌斑点叉尾鮰后对血清生化指标的影响和对斑点叉尾鮰红细胞的损伤情况。结果显示：不同剂量实验组甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)含量在整个试验阶段变化不大,与对照组相比,均无显著性差异(P>0.05)。染毒的第4d,三个浓度用药组的血清谷丙转氨酶(ALT)含量与对照组相比,存在显著差异(P<0.05),斑点叉尾鮰外周血红细胞微核率、核异常率有升高,但差异不显著(P>0.05),揭示了一定浓度的DOTC对斑点叉尾鮰的肝细胞可能造成损伤,在本实验浓度下DOTC对斑点叉尾鮰无明显的细胞毒性效应。2.多西环素在斑点叉尾鮰中药代药残研究。(1)研究了不同水温(18±1℃和28±1℃)下,以20mg/kg鱼体重单次口灌DOTC后斑点叉尾鮰体内的药物动力学,并在同等条件下与鲫的代谢规律进行比较。结果表明：DOTC在斑点叉尾鮰和鲫体内的药时数据均符合二室开放式模型,药-时曲线呈明显双峰现象。在水温18℃条件下,DOTC在鱼体血浆和组织中的分布较慢,消除也慢；在水温28℃条件下,DOTC在鱼体血浆和组织中的分布较快,而消除也相对低温快。高温条件下组织中的浓度均比低温条件下的浓度高,且第二次达峰浓度Cmax(2)均大于第一次的浓度Cmax(1)。在血液中,鲫对DOTC的吸收速率和消除速率均较斑点叉尾鮰慢,吸收半衰期(T1/2Ka)、达峰时间(Tp)均较斑点叉尾鮰快得多而消除半衰期(T1/2β)较斑点叉尾鮰慢,血药浓度-时间下面积(AUC)仅为斑点叉尾鮰细的1/3。(2)研究了不同水温(18±1℃和28±1℃)下,DOTC在斑点叉尾鮰体内的残留消除规律。结果表明：DOTC残留的消除速度随水温降低而减慢,与其他组织相比,DOTC在肝脏中的消除最慢。若按DOTC在可食组织肌肉+皮中最高残留限量300μg/kg计算休药期,建议休药期分别为22d和19d。3.多西环素壳聚糖纳米粒冻干粉的制备及其评价(1)采用离子交联法和冷冻干燥法制备了DOTC壳聚糖纳米粒冻干粉,以正交试验优化处方与工艺,并与DOTC原料药进行稳定性和体外释药特性对比研究。结果,DOTC壳聚糖纳米粒冻干粉制备工艺切实可行,稳定性良好,并具有显著的缓释特性。按壳聚糖浓度为2.5mg/mL、三聚磷酸钠浓度为1.2mg/ml、DOTC用量为8.0mg、pH值为5.5的处方制备的DOTC壳聚糖纳米粒冻干粉复溶性良好,电镜下观测发现纳米粒平均粒径为(126.3±17.8)nm,平均包封率为(56.52±2.1)%,平均载药量为(16.83±0.27)%。与原料药相比,10dDOTC壳聚糖纳米粒冻干粉的(4500±500)Lx强光降解率减少22.97%,40、60℃热降解率分别减少18.72%和31.41%,75%、92.5%高湿降解率分别减少20.45%和26.90%。DOTC壳聚糖纳米粒冻干粉在人工胃液中释药较快,其次是人工肠液和pH7.4磷酸盐缓冲液,且人工胃液在pH2-4范围内,随着pH值增大,冻干粉释放度减小。(2)在(25±1)℃,对DOTC壳聚糖纳米粒冻干粉(DC-CS-NPs)与DOTC原料药进行药代动力学与组织分布规律进行比较研究。结果,DC-CS-NPs在血浆、肝脏、肾脏、肌肉中的双峰现象变为单峰现象。与DOTC原料药相比,DOTC壳聚糖纳米粒冻干粉在肝脏、肾脏、肌肉的峰浓度减小,达峰时间延长；在血浆中的峰值时间明显延长,峰浓度减小,消除半衰期延长,药-时曲线下面积变大,相对生物利用度为DOTC原料药的116%。4.多西环素对嗜水气单胞菌药动-药效同步模型的研究(1)建立了DOTC对A.h的体外PK-PD模型。测定了模型中药物动力学和DOTC抑制A.h的药效学参数,并研究了它们之间的关系。结果,在消除半衰期为38.61h的模型内,2MIC的DOTC对A.h仅能抑制3h,模型运行3h后细菌出现再生长。4、8和16MIC的DOTC对A.h能够起到持续的抑制作用。结果表明,DOTC对A.h的药效与药物浓度关系密切。当Cmax/MIC>3.96时,DOTC能够对A.h起到持续的抑制作用。(2)建立了DOTC对A.h的半体内PK-PD模型。采用体内药动学和体外药效学相结合的方法,研究了斑点叉尾鮰血清中DOTC抗A.h的活性,数据使用3p97和kinetica4.4软件分析。结果,斑点叉尾蛔按20mg/kg体重的剂量口灌DOTC后,药物吸收迅速、达峰快、消除缓慢,血浆药物达峰时间(Tmax)为2.57h,峰浓度(Cmax)为1.72μg/mL,消除半衰期(T(1/2)β)为38.63h。在半效应室内,半效浓度参数(EC50)为16.95h。PK-PD同步模型参数Cmax/MIC血清为0.86,AUC0→24h/MIC血清为20.57h。通过抑制效应的SigmoidEmax模型方程可得到临床起到抑菌效果的最佳给药剂量范围为10.68-41.42mg/kg体重。5.采用改进的碳二亚胺两步法将多西环素半抗原与载体蛋白BSA连接制备人工免疫抗原,并用同样方法将DOTC与载体蛋白OVA连接制备人工包被抗原。经紫外扫描分析和动物免疫试验证实DOTC人工抗原合成成功,经动物免疫试验所得抗血清效价为2.