【食品中单增李斯特菌检测方法技术发展综述5500字（论文）】

前言随着市场经济的不断发展壮大，我国开展全球性食品贸易在迅猛增长，食品加工和销售方式也发生了很大的转折和变革，虽然食品的流通速度加快了，但安全性却呈现下降的趋势，导致食源性疾病患者人数不断上升[1]。无论是发达国家还是发展中国家，食源性疾病已经危害着人类的身体健康与生命安全，也对经济产生了重要的冲击。所以，食源性疾病已逐渐成为我们当前必须面对的严峻挑战[2]。对中国多年来食源性疾病监测数据的分析表明，由微生物引起的食源性疾病占疾病和事故总数的近40%，这也是导致患者人数最多的原因[3]。其中，单增李斯特菌俗称冰箱细菌，被认为是最常见的食源性病原体，引起了国家卫生安全部门的高度重视[4]。然而，由于其广泛存在于多种食品中，尤其是冷冻食品中，很难实现对细菌的完全控制。为了减少食物中毒的发生，有必要对食物中的污染和检测方法进行有效的探索和研究。。我国食品安全环境严重污染引发的各类食源性疾病和重大事件具有群体性、突发性的基本特征，有可能演变为重大的食品公共安全隐患危机。因此，快速准确地发现病原菌是应对食源性疾病暴发的关键步骤[5]。此外，随着我国粮食生产的高度集中和原料来源的高度全球化，食源性疾病暴发具有暴发时间长、地域广、群体大的新特点。在分子生物学方面，为了解决这种生物危害，需要通过对冷链运输和仓库贮存等各个环节进行实时的监控以及确定其污染源，因此，采用高效、快速的污水检测技术就显得尤为重要[6]。传统的快速检测方法在食品中对于实验器械的质量要求较低、可靠性和灵敏度较高、费用少、但由于其操作复杂，且检测持续时间长，致使食品中单增李斯特菌的快速检测不能直接实现。对此本文基于国标法对分子生物检测学的实时PCR和环介导恒温扩增两种方法进行比较分析讨论。一、单增李斯特菌存在现状单核细胞增生李斯特菌仍然很普遍，但大多数人缺乏健康意识，导致食物中毒。随着食品检测范围的扩大，细菌检测的关键问题仍然是如何结合现有检测方法和创新思路，建立快速、准确、分级的检测体系。同时，它降低了检测成本，使其更加实用[7]。一系列相关问题也将是未来很长一段时间内需要解决的问题。1983年3月，加拿大政府报告指出因为长期进食各种受李斯特菌污染的新鲜凉拌菜而引起了新型食源性人类李斯特菌病。2011年3月美国首次报道了因进食单增李斯特菌受到食物污染的哈密瓜而中毒造成146名孕妇流产，30例病人死亡。西班牙2013年1月到2014年月间，因为感染了李斯特菌病死亡的患者中有1例急性流产，3例腹部流血导致死亡。虽然在购买即食用的食品中李斯特菌很少，能够达到欧盟的相关食品安全检测标准，但是对于人类李斯特菌的致病感染率却在进一步提高。国际上已经成功开展了对多种食源性新型单增李斯特菌的临床筛查，研究了各类食品中各种单增李斯特菌的具体病理学特性和与之密切相关的食品检测方法手段，探索出更加迅速、便捷、准确、安全的食品检测方法手段。对于有效减少各种食源性肠道疾病的发生事件，及时有效地控制各种病原菌的大量传播以及其他各种严重后果的发生等都具有十分具有重大的科学意义[8]。在食品中进行致病菌的检查，主要内容包括两个部分：一是通过食物样本中的分离、富集等来检查待测的病原菌；二是进一步提升检测的速度与准确率。目前我国用来检测食源性致病菌的技术主要分为以下三种：传统的分离鉴定法、免疫学检查方法及分子生物学检查法。传统分离鉴定方法，对于单增李斯特菌的检测主要有国家标准中的EB(EnrichmentBroth）增菌法和LB(Luria．Bertani）增菌法，通过对细菌微生物的协同分离增菌培养、生化化学反应、溶血增菌试验、协同联合溶血增菌试验、动物溶血试验等研究方式等来实现增菌，这些增菌实验方法研究结果对于科学仪器和实验设备的质量要求不高，可操作性强，但是增菌检验的工作周期相对较长，大概需2周时间[9]。国家标准方法是根据我国国家标准《食品卫生微生物学检验：单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB4789.30—2008）规定而制定的方法，这种方法通常需要5-14天。但是这种方法很容易导致假阳性和假阴性等异常情况，并且存在着肉眼不能区别的杂菌，这些问题还需要进一步的验证。而受传统检验技术的限制，从可疑食品中分离致病菌则较为困难，如发生在德国的大肠杆菌0104食物中毒，是在食物中毒发生后的近一个月才确定致病食品。这种传统分离鉴别方法已经难以适应在网络技术下对食品制造商在生产销售过程中的网络分析、食品上市及消费前快速分析等要求。虽然在一些传统食品中对于单核细胞增生性李斯特菌的检测方法可以直接进行确定性和测量化，灵敏度高，成本低，但耗时长。免疫学技术具有较高的准确性和特异性，但在测定前需要预处理。免疫印迹技术（immunoblotting）是一种新的免疫化学技术，它利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分离不同分子量的蛋白质组分。将获得的不同条带与待检测血清中的相应抗体结合，并通过显色来判断患者的感染。免疫印迹法是一种非侵入性的诊断检测方法，同时具有敏感性高、特异性强、检测方法简单、时间短等优势。分子生物学方法快速准确，但生物标志物成本高。代谢组学方法可以方便、准确地测定食品中的单核细胞增生李斯特菌，但需要对目标菌进行过夜培养并建立合适的数学模型。生物传感器法灵敏、简单，适用于食品中李斯特菌的快速检测，但其稳定性和使用寿命有待提高。所以寻求一种快速、准确而高效的检测方法是测定单核细胞增生李斯特菌所要面临问题中的重中之重。二、PCR在单增李斯特菌的检测技术中的应用（一）PCR简介聚合酶链反应（PCR）是一种在体外扩增特定DNA片段的方法。根据目标DNA模板片段，设计相应的上游引物和下游引物，在合适的条件下进行反应。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测时间短等特点。聚合酶链式反应（PCR），经多次变性、退火、延伸后，实现目的核酸片段的指数扩增。PCR在单增李斯特菌中的检测原理就是先通过PCR方法将单核细胞增生李斯特菌分为几个特定的血清群，然后根据分组结果使用特定因子血清，根据抗原与抗体之间的特异性凝集反应，进行玻片凝集试验，确定单核细胞增生李斯特菌的特异性血清型。与仅使用因子血清检测血清的方法相比，该方法大大节省了检测时间，提高了检测效率。（二）PCR在单增李斯特菌的检测技术中的应用现状美国科学家KaryMullis在1985年发明了PCR[10]，该种准确检测食物方法因具有食物化学特异性强、灵敏度高、迅捷简便等四大特征，在准确检测各种食物的lm和化学元素质量等方面已经具有很大的科学研究应用潜力。随着PCR检测技术的发展，实时PCR在原先的核酸分子实时电磁辐射定性检测技术的研究基础上进一步改良和优化已逐步形成为现在的实时电磁辐射核酸分子定量检测技术，具有实时扩增检测、高准确度、操作简单、高通量、高灵敏度、高特异性等六大功能[11]。林玉双等人就实时荧光PCR法检测乳粉中单增李斯特菌的比较研究，得出RT-PCR法可用于实验室乳粉中单增李斯特菌的检测，具有积极的作用[12]。三、环介导等温扩增在单增李斯特菌检测中的应用（一）环介导等温扩增简介环介导等温扩增主要原理是通过研究和设计4条具有特异性的新引物曲线，准确鉴定靶等位基因的6个位点和亚区，并利用一种新的具有链核酸取代活性的BstDNA核酸聚合酶。在65℃的单条环介导基因恒温扩增条件下直接对其进行一条环介导恒温核酸链的扩增，检测的实验结果显示可以用光学肉眼直接观察到在离心管底部表层存在着一种白色的核酸沉淀物和产生物并进行了初步判断[13]。环介导等温扩增检测单核细胞增生李斯特菌是根据单核细胞增生李斯特菌HLA基因保守区设计的两对引物。采用反转录和环介导等温法在同一体系中扩增单核细胞增生李斯特菌RNA。以最终浓度为200的羟萘酚蓝作为等温扩增产物的指标。无需打开盖子即可通过凝胶电泳直接检测。根据样品的颜色变化，可在20小时内（包括富集时间）直接检测到李斯特菌RNA的存在。（二）环介导等温扩增在单增李斯特菌检测中的应用现状徐匆探究了单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法，得出环介导等温扩增方法的灵敏度是RT-PCR的10倍，能够检测出牛奶中是否存在着单增李斯特活菌，应用价值非常高[14]。LAMP实验方法分别在单增模型细菌样品和新鲜实验细菌样品的两次检测中均具备了良好的特异性和检测灵敏度，通过LAMP试验获得了15份单核细胞增生李斯特菌核酸阳性细菌和生肉细菌样品[15]。四、PCR与环介导等温扩增两种测定方法分析与研究进展（一）PCR与环介导等温扩增两种测定方法对比PCR法可以检测多种多样的样品，例如对组织、血液、乳汁等进行抗原检查。曾有研究显示PCR有高达96%的特异性，还有63%左右的敏感性，但也具有假阳性的缺点，相同条件下不同操作者的结果会产生差异，而且环境中的其他分枝杆菌也可与IS900片段结合，且扩增出与设定片段相同的条带[16]。虽然PCR技术是一种快速诊断方法，但在需要鉴别检测多种病原时，单项PCR方法比较费时[17]。环介导等温扩增技术在恒温条件下（65℃左右）加入链置换DNA聚合酶，可在40-60min之内完成核酸扩增反应，将目标DNA片段扩增109～1010倍，具有恒温快速扩增和高特异性的特点[18]。有研究指出LAMP两种核酸测定方法都能够精准地检测出单增利氏李斯特菌，传统的PCR实验方法的细菌检测结果精确性有限，增菌液样品中的单增核酸杆菌含量远远超过了细菌阈下的值，由此也导致的假细菌阴性检测结果[19]。（二）单增李斯特菌检测技术研究进展随着当前我国现代分子细胞生物学的检测理论和检验技术的不断完善和发展，相关现代分子细胞生物学的重要检测工具和检验方法技术诸如PCR技术、核酸抗体探针式基因杂交检测技术、基因芯片、漏声抗体表面检测波形和生物化学传感器等都已经在对各类病原菌的科学检测和生物科学技术研究中被广泛应用[20]。基于脱氧核酸的这种分子生物学检测技术主要是对所有病原菌体细胞和致病微生物的科学检测，是物种名的识别、物种的进化起源、多样性的科学评估以及其与动物亲缘体的关系、体质变化演变等常见的科学研究工具和检测手段，也是病原微生物快速诊断的主要技术方法之一[21]。五、结语单增李斯特菌是常见的一种食源性致病菌会引起食物颜色变深、产生不良气味等，引起腐败。会对人体产生严重的伤害，污染初期不易检出，因此建立能够及时识别与发现单增李斯特菌的检测方法，对我国食品产业快速、健康发展具有重大意义。目前，单增李斯特菌的检测方法众多，当前主要为PCR以及环介导等温扩增方法，本文首先简要、详细地介绍了本课题主要研究成果发展的历史背景、目标和技术意义，然后针对于当前食品安全领域存在的突出问题、单增李斯特菌及其他多种食源性食品致病菌实时检测检验技术等问题进行了了相关问题讨论，最后针对于应用单增李斯特菌的实时检测检验技术分别提出了两种实时PCR和实时LAMP，这两种不同检测方法的特异性和灵敏度，以及单增李斯特菌检测技术研究进展，以期促进单增李斯特菌的检测技术发展。参考文献[1]徐匆，罗华，建黄皓，梁卫驱，胡珊，李艳芳，胡楚维，罗鸿斌，单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法的建立[J].现代食品科技，2020，36（6）[2]武鑫，食品中单增李斯特菌快速检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019，10（18）[3]徐匆,罗华建,黄皓,等.单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法的建立[J].现代食品科技,2020,36(6):6.[4]尚丛珊，食源性致病菌单增李斯特菌检测技术的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2020，11（14）[5]马盼盼，夏丹丹，赵莹莹，郜晓峰，康文艺，食源性单增李斯特菌检测方法研究进展[J].河南大学学报:医学版，2019，38（4）[6]逯岩，祝琳，食品中单增李斯特菌的存在现状及检测方法研究[J].中国医药指南，2020，18（21）[7]李云霞，陈雯雯，顾晨荣，饶名祯，郭鲁申，赵渝，单增李斯特菌的检测方法研究进展[J].上海师范大学学报：自然科学版，2015，44（6）[8]贾培，盛司，兰全学，单增李斯特菌恒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