柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程 编制说明

1《柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程》起草单位：全国农业技术推广服务中心、华南农业大学、西南大学柑桔研究所负责人：冯晓东联系电话：010—59194524邮箱：njzxjyc@一、工作简况，包括任务来源、起草人员及其所在单位、起草过程等（一）任务来源根据《国家标准化管理委员会关于下达2022年第三批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》（国标39号）20221115-T-469项，由全国植物检疫标准化技术委员会主持承担《柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程（GB/T28062-2011）》的修订工作。（二）主要起草单位该标准修订由全国农业技术推广服务中心牵头，华南农业大学、西南大学柑桔研究所参与。（三）编写人员与分工标准由全国农业技术推广服务中心牵头修订。冯晓东作为首2席专家。标准制定过程主要由全国农业技术推广服务中心牵头，华南农业大学、西南大学柑桔研究所3个单位人员参与。具体承担的主要起草人员及任务分工见表1。表1主要起草人员信息及任务分工（四）主要工作过程任务下达后，首先成立编制工作小组，制定工作计划、工作步骤等，专题研究和落实相关任务，并进行具体工作分工。标准主持单位全国农业技术推广服务中心长期致力于检疫标准化工作，已先后承担制定了60余项国家标准和农业行业标准；标准主要起草人员多年从事柑橘黄龙病的相关研究工作，积累了大量有关柑橘黄龙病检测的经验。在此基础上，进一步收集整理有关技术资料，并按标准的要求对搜集的有关资料进行分类编排与综3合研究分析；同时，组织认真学习GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》等一系列有关标准编制的文件，按照标准编写的要求，综合行业普遍做法，进行标准制定工作，2023年8月完成《柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程》征求意见稿。二、标准编制原则、主要内容及其确定依据（一）标准编制原则本标准编写格式，依据GB/T1.1—2020标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则要求进行。柑橘黄龙病是柑橘生产上最具毁灭性病害，柑橘黄龙病的检疫检验是黄龙病防控的重要组成部分，是阻断黄龙病传播的有效途径和重要手段。为规范柑橘黄龙病检疫检验程序，农业部于2011年制定了《柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法》（GB28062-2011）。距该标准制定已过去11年，随着柑橘黄龙病菌基因组的测序与公布，在黄龙病菌的PCR检测上发现了更为特异且灵敏的检测引物，可进一步优化黄龙病PCR检测的准确性与灵敏性。因此，有必要对《柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法》进行修订重新发布。本标准的修订重点考虑了各级植物检疫机构目前的基础设施条件和人员技术水平，从柑橘黄龙病菌定量PCR检测技术的准确性、可操作性、实用性、针对性入手，使规程内容更准确、条理更清晰，更易于掌握和操作，适宜基层检疫人员应用，切实解决柑橘黄龙病检疫检验的实际问题。本标准的语言表述规范，用语准确、简明，结构严谨，布局合理，具有较强的科学性、实4用性和先进性。（二）本标准的主要内容本标准包括范围、规范性引用文件、术语和定义、柑橘黄龙病基本信息、方法原理、实验室设置、主要仪器设备和试剂、取业部分）》等法律法规的规定，以及柑橘黄龙病基本信息及其PCR检测技术的相关流程、成果与检测数据，包括取样及样品贮运与保存、样品DNA制备、PCR扩增、质控与结果判定标准（三）修订的主要内容本次修订在《柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法》（GB28062-2011）的基础上进行了调整，主要有以下8个方面。1.全文将“柑桔”修改为“柑橘”。2.在范围部分，将“柑桔黄龙病亚洲韧皮部杆菌”修改为“柑橘黄龙病病原韧皮部杆菌亚洲种”。修改“黄龙病亚洲韧皮部杆菌”为“韧皮部杆菌亚洲种”。3.在柑橘黄龙病基本信息部分，修改“亚洲韧皮杆菌”为“韧皮部杆菌亚洲种”，修改“非洲韧皮杆菌”为“韧皮部杆菌非洲种”，修改“美洲韧皮杆菌”为“韧皮部杆菌美洲种”。4.在取样方法部分。对叶片样品的采集根据症状进行区分采样，修改为“疑似病树优先采集疑似斑驳黄化症状的叶片，如无典型症状，按树冠东南西北四方采集，每点取上中下部叶片各51片，每棵树共采集叶片12张。”果实样品中增加“橘络”组织样本。便于植物检疫人员能更准确地采集疑似黄龙病相关的样品，从而提高检测的有效性。5.在结果判定与表述部分。在质控标准中，阳性对照的Ct值从“应<28.0”修改为“应≤30.0”。对特殊情况样本的判断中建议“用在基因组中有5个拷贝的核苷酸还原酶基因引物进行实时荧光PCR复测”，以进一步提高检测的准确性。6.在附录D柑桔黄龙病的症状鉴定部分，替换了部分黄龙病的症状图片，删除柑橘木虱模型图替换为实物图，同时补充对柑橘木虱的详细描述，以便于植物检疫人员能更准确地采集黄龙病及柑橘木虱相关样品。7.在附录F检测试剂配制及实时荧光PCR检测部分，将CQULasR03替换成特异性更高的HLBas-G/CLas-4G（5'TCGAGCGCGTATGCGAATACG-3'/5'AGTCGAGCGCGTATGCGAAT-3'）并增加荧光标记探针HLBp（序列为5'-AGACGGGTGAGTAACGCG-3'以进一步提高韧皮部杆菌亚洲种检测的特异性。8.增加附录G部分，增加靶标韧皮部杆菌亚洲种核苷酸还原酶β基因（nrdB基因）的实时荧光PCR检测，以用于复测基于16SrRNA基因引物HLBas-G/CLas-4G检测时Ct值大于35但小于40的样品。三、试验验证的分析、技术经济论证以及预期效益6经过多次试验论证，与原标准相比，修订后的《柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程》适用范围更加明晰，取样更为准确，检测的准确性与灵敏性更优。四、国际、国外同类标准技术内容的对比情况目前尚无相关国际标准。五、以国际标准为基础起草的情况、是否合规引用或者采用国际国外标准六、与有关法律、行政法规和其他强制性标准的关系，配套推荐性标准的制定情况本标准属基础性标准，是根据《植物检疫条例》《植物检疫条例实施细则（农业部分）》等法律法规对农