辅助生殖科冷冻胚胎移植技术操作规范

冷冻胚胎移植技术操作规范“以冷冻胚胎移植为核心的IVF策略”不同于传统超排卵周期因卵泡多为防止OHSS或因孕酮高不适合新鲜胚胎移植不得已而采用全胚冷冻。“以冷冻胚胎移植为核心的IVF策略”是主动的全胚冷冻，包含四个基本要素：简单的促排卵方案、全胚冷冻、主要在自然排卵周期进行冷冻胚胎移植、简单的黄体支持。冷冻胚胎移植涉及以下关键问题：内膜准备、胚胎内膜同步、黄体支持。第一节、冷冻胚胎移植的内膜准备冷冻胚胎移植可以在自然周期、微刺激周期和激素替代周期进行，前两种称为有排卵周期。排卵后有黄体形成，移植后黄体支持简单，应该尽量在有排卵周期进行冷冻胚胎移植。一、自然排卵周期内膜准备适用于排卵正常，周期23-30天的妇女。月经周期第10天前排卵的妇女不适合自然周期冷冻胚胎移植，可以用来曲唑推迟排卵2天。周期超过30天的妇女监测时间较长，也可以用来曲唑促排卵，缩短监测次数。准备自然周期冷冻胚胎移植的患者，根据月经周期长短从月经周期第10天-12天开始用尿LH试纸监测，每天一次，用晨尿测定。若LH开始显示，来院抽血查性激素：FSH,LH,E2，P4，同时超声监测，注意内膜厚度、形态、卵泡大小、有无输卵管积水。注意少数妇女LH峰不典型，尿LH测定一直阴性，若LH一直阴性，月经周期第14-15天来院查性激素和超声监测。1、若血LH水平超过10miu/ml，E2超过200pg/ml，且内膜超过8mm，形态正常，卵泡平均直径大于16mm，标志着LH峰已经出现。2、若血LH超过10miu/ml，但小于20miu/l，E2、P4仍低，卵泡平均经线小于15mm，应该第二天复查，判断LH峰是否真正发生。3、若血LH水平低于20mIU/ml,且P4低于1ng/ml,即LH处于上升期，当日夜晚9点注射HCG10000U，+5天上午9-10点解冻D3胚胎，+7天上午9-10点解冻D5-7囊胚4、LH水平等于或大于20mIU/ml,或P4大于等于1ng/ml,即LH峰处于下降期，当日下午2-5点注射HCG10000U，+4天上午9-10点解冻D3胚胎，+6天上午9-10点解冻D5-7D囊胚。5、若已经排卵、P4在1-2ng/ml之间，为排卵第一天，立即注射HCG10000U，同时开始使用达芙通和安琪坦或雪诺酮，+3天上午9-10点解冻D3胚胎，+5天上午9-10点解冻D5-7D囊胚。一般口服达芙通支持黄体已经足够，不再监测内源性孕酮，不注射黄体酮油剂，方便病人。6、夜晚9点注射HCG10000U的，+3天开始口服达芙通下午2-5点注射HCG10000U的，+2天开始口服达芙通(达芙通用量20mgBIDPO)。7、若注射HCG日卵泡平均直径低于15mm，可能发生黄体功能不全，应该加强黄体支持，口服达芙通同时阴道塞黄体酮，如安琪坦0.2gbidpv，或雪诺酮1支pv。8、注射HCG后到移植日不再监测，移植日测内膜，移植后不监测内源性孕酮和雌激素。9、取消移植标准：E2高峰日，或冷冻胚胎移植日内膜厚度低于8mm；E2高峰值低于150pg/ml，LH峰日卵泡小于14mm，或不能确定排卵时间，或内膜形态异常均应该取消移植。二、微刺激周期的内膜准备1、来曲唑微刺激(来曲唑的用量应根据月经周期长短决定)：①周期30--34天，来曲唑第一周期用量2.5mgqd3天。②周期35--40天，来曲唑第一周期用量5mgqd3天。③周期超过40天，来曲唑第一周期用量5mgqd5天。④周期第10天前排卵，或卵泡14mm以下排卵的妇女，可以用来曲唑推迟排卵。来曲唑2.5mgqd3天。来曲唑用量越大需要添加的HMG用量越少，卵泡越少，雌激素越低来曲唑用量越小--需要添加的HMG用量越大，卵泡越多，雌激素越高。一般从月经周期第3天开始口服来曲唑，用药起始日后7天超声监测：主卵泡超过14mm,不需要加用HMG主卵泡不足14mm，加用HMG150uimqod,2-3次复诊2、HMG晚刺激若月经第12天主卵泡小于10mm，用HMG促排卵，HMG150imqod，根据卵泡的大小决定用药次数，促排卵的同时监测尿LH。一般HMG晚刺激周期卵泡在15mm出现LH峰。无论是自然周期还是微刺激周期做内膜准备，均采用严格同步的方法，同步方式和黄体支持同自然周期。三、激素替代周期的内膜准备为减少病人痛苦，尽量不采用激素替代做冷冻胚胎移植，HRT有指证进行。适用于：①FET反复自然周期失败；②.不明原因不孕自然周期FET失败；③自然周期内膜<6mm；④周期<23d、周期第10天前排卵或卵泡<14mm有LH峰出现者；⑤异常出血(排卵期出血、经期延长)的患者。内膜薄、异常出血的患者应该先做宫腔镜，有排卵周期胚胎移植失败的患者、有人工流产史、宫腔手术史、结核史的患者应该先做宫腔镜检查。激素替代前一般不需要降调节，从月经周期第3天直接使用雌激素。子宫肌腺症是否需要在激素替代前作降调节没有确切的证据，如果内膜正常，子宫肌腺症患者在激素替代前没有降调节的必要。为有效抑制卵泡发育，使用乙炔雌二醇25微克tidpo14天，若患者对乙炔雌二醇胃肠道反应严重可以换成芬吗通红色片，4mgbidpo14天。应用雌激素14天后超声监测内膜厚度、形态，注意有无卵泡发育。血激素检查注意孕酮水平，如果孕酮超过1.0n/ml，周期取消。如果内膜厚度达到8mm、孕酮未升高可以考虑使用孕激素转化内膜，或根据工作安排决定开始使用孕激素进行内膜转化的时间。如果使用14天雌激素后内膜达不到8mm，并且无卵泡发育、无孕酮升高，应该延长雌激素使用时间：维持原来的雌激素剂量不变，同时加用芬吗通白色片1mgqnpv,阿司匹林50mgbidpo防止血栓。1mg芬吗通阴道塞药血清雌二醇水平可以达到100-1500pg/ml。特别注意向患者交代在孕激素转化内膜前不可以使用含有地屈孕酮的芬吗通灰色片。激素替代最长可以达到35天，过长时间的雌激素使用内膜突破性出血的可能性大大增加。达到上述使用孕激素转化的标准后，停止使用原来口服的雌激素，口服芬吗通黄色片2片bidpo，同时阴道塞黄体酮(安琪坦0.2gbidpv，或雪诺酮1支pv)，维持原来阴道使用的芬吗通塞药，和阿司匹林。决定内膜转化日，+3天上午9-10点解冻D3胚胎，+5天上午9-10点解冻D5-7D囊胚。不监测外周血孕酮。四、尿LH测定为了提高就诊效率、优化就诊流程，尿LH检测不失为一种辅助医生做出判断和处理的有效手段。通常情况下，采用轻微刺激、人工授精、自然周期等促排卵方案时，因监测频度稍高，为了减少等待时间，采用血激素和尿LH测定相结合的方法，可以提高就诊效率。进行卵泡期非降调节的促排卵或自然周期监测的患者，应常规监测尿LH，开好尿LH试纸后，根据月经周期长短和具体促排卵方案告知患者开始测尿LH的时间和方法。尿LH的检测方法是否正确尤为重要，医护人员应告知患者检测时要看到尿液被吸进观察窗，方能取出，应5分钟后观察，若观察太早不易发现LH峰，容易漏诊，早晚各测1次LH试纸更易发现LH的变化。很多人可能不会出现说明书上提示的强阳性，即T和C线深浅相同，所以要提醒患者不能等强阳就诊，否则会错过排卵时间。医护人员应告知患者复诊当日携带尿LH试纸给主管医生看，以利于主管医生快速做出判断，减少患者在医院的等候时间，提高就诊效率。有关尿LH的具体测试方法和注意事项参看黄体期促排卵章节的有关部分。第二节、胚胎移植手术一、胚胎移植基本原则胚胎移植是影响辅助生殖技术效率的重要环节，胚胎移植技术的好坏直接影响到试管婴儿的成功率，因此参与胚胎移植的实验室和临床工作人员都应重视胚胎移植的规范操作。移植时间：移植时间应根据冷冻胚胎的内膜准备所述的方法进行。1、移植胚胎数：挑选形态最佳的胚胎做移植，移植分裂期胚胎不超过2个，移植囊胚不超过2个。移植胚胎的数量应征求病人的意见，告知多胚胎移植可能发生多胎妊娠。胚胎评价及分级标准见附录。操作要点：移植过程的各个操作应轻柔，努力做到无损伤操作。2、移植前准备：①移植当天早上8点阴道超声检查内膜厚度、有无宫腔积液，若有输卵管积水则在移植前抽掉积水；确认无误通知实验室开始解冻胚胎；②根据当日取卵手术量决定具体移植时间并告知病人，胚胎解冻后谈话签字，向病人交待胚胎移植前需充盈膀胱。③通知实验室具体的胚胎移植时间，以便实验室作相应准备。包括：预温一个4孔培养皿、巴士德管、毛细巴士德管、胚胎移植内管；胚胎移植前日将移植液放培养箱内平衡至少8小时等。④移植前阴、腹B超检查，观察子宫位置、屈度、从宫颈外口到宫腔底部长度、子宫内膜厚度及形态、有无宫腔积液、卵巢大小、有无输卵管积液、有无盆腔积液等。若有宫腔积液则应抽除积液并推迟移植。若有过激表现则取消移植。决定推迟移植或取消移植的病例，临床医生应将决定通知实验室。内膜厚度低于5mm或发生过早LH峰可不做新鲜胚胎移植所有胚胎于原核期进行冷冻保存。二、胚胎移植过程物品：胚胎移植包、胚胎移植管、孔巾、温生理盐水、庆大霉素8万单位、漏斗、带腹部探头的B超。1、阴道准备：患者膀胱截石位上身平卧，术者带无菌手套，生理盐水擦洗外阴后铺孔巾，上窥阴器，生理盐水加庆大霉素擦洗阴道及颈管，注意应可能的将宫颈粘液清除但需避免颈管出血，若宫颈粘液多可用胚胎移植管的外套管插入宫颈管内将粘液吸出(做移植时应使用新的外套管)。2、助手腹部超声做子宫扫描，纵切子宫显示离宫底3CM处即为外套管最深点(TDT管)。3、插外套管：胚胎移植管拆封后移植内管连同其包装袋递交给实验室放胚胎操作箱内保温，外套管交术者，注意拿外套管时术者不可碰触导管前后端。取出外套管内芯在腹部超声引导下将外套管插入到距宫底3cm处，并通知实验室外管已插好，实验室开始装胚胎。若不用内芯插管困难可上宫颈钳牵拉宫颈，重新插管；若仍插管困难加用内芯用无菌纱布包裹移植管外管前端做适当弯曲后插管；若仍很困难可尝试更换窥阴器、腹部按压、改变体位后插管，若仍无效应推迟一天移植，次日移植前口服安定5毫克或在麻醉下移植。4、装胚胎：当临床医生开始做插管前准备时实验室人员做移植准备，打开胚胎实验室内、外门，操作箱充气后将移植液取出，在操作箱内用经过移植液洗涤的巴士德管将移植液吸出加入到四孔培养皿的1-3号孔中，各孔的液体量分别为0.5-0.8ml、0.8ml、0.5ml，将胚胎从培养箱内取出置操作箱内，用经移植液洗涤的毛细巴士德管将待移植的胚胎转移到3号孔中经洗涤后转移到1号孔中，集中放置在9点位置。取一个1mlBD注射器，反复抽拉活塞，去针头将注射器接到胚胎移植管内管上，将内管从保护套内取出，尖端置入2号孔内，上抽注射器活塞将0.3-0.5ml移植液吸入到内管及注射器内，当注射器内液面不在上升时拔出注射器，将注射器直立上推活塞排除气泡，再将注射器与内管接紧，将内管前端再插入2号孔液体中压紧活塞后弹开待管内压力平衡后按下述步骤装胚胎：空气5-7mm、胚胎及移植液7-10mm、空气2-3mm、移植液2mm。注意整个操作过程应遵守无菌操作原则防止移植管内管前端5cm、巴士德管前端10cm、毛细巴士德管1cm接触非无菌区。5、移植：实验室工作人员将已装好胚胎的移植管内管送交临床人员并递送到术者手中，术者应迅速将内管插入到外管中直至内外管前端平齐，在助手腹部超声的引导下将内管前端插入到距宫底0.3cm处，当内管到达指定位置后保持内管位置不变将外管后退双手紧压注射器活塞将胚胎注入宫腔，立即将内外管取出送实验室检查有无胚胎残留。注入胚胎时及退管后应注意观察气泡在宫腔内的位置。6、检查移植管：实验室人员将胚胎移植管内管尖端放置在2号孔液面上，用力压注射器活塞将管内空气排出，然后将尖端插入移植液中来回抽拉注射器活塞并在显微镜下观察有无胚胎流出，同时注意粘液量的多少和血液污染。保持内管尖端在2号孔中将注射器从移植管上取下，注射器活塞上拉，再次将注射器接在内管上，缓慢下推注射器活塞将内管中的液体全部排入到2号孔中，同时在显微镜下观察有无胚胎残留。若有胚胎残留应通知临床医生立即再次移植，再次移植时更换新的胚胎移植管。7、临床医生和实验室人员按照胚胎移植记录单的内容逐项填写移植过程。三、胚胎移植后处理1、移植后病人即可回家。2、移植后嘱患者保持正常的工作和生活状态，不必卧床休息。按照移植前医嘱用药。3、嘱病人移植后14天做尿妊娠试验，若阴性，可过三日再次复查；若妊娠，继续黄体支持，并于二周后复查B超。四、附录—胚胎分级标准1、原核期胚胎分级标准原核分级仅限于双原核受精卵根据：原核的大小、距离、位置；核仁的数量、大小、分布等进行分类：Z1、Z2、Z3、Z4，由Z1-Z4胚胎质量下降。Z1、Z2、Z3具备以下共同特征：两原核大小相称、位于中央两原核靠拢。Z1：双侧原核中核仁数在3-7之间，核仁数相等、大小适中；双侧原核中核仁在两原核交界处排列成线Z2：双侧原核中核仁数在3-7之间，核仁数相等、大小适中；双侧原核中核仁呈散乱分布Z3：双侧原核中核仁数不等、分布方式不同、大小不称Z4：双侧原核未靠拢、原核大小明显不等、原核不在卵中央根据ScottL.HumReprod.15(11)p2394-2403,2000修改2、WIH评分系统细胞分数=细胞数评分+碎片评分+对称评分，分数越少胚胎质量越差。天数分数4分3分2分1分0分D2细胞数4-6212PN碎片程度0%<10%10-25%26-49%>50%裂球对称------------------------稍不对称很不对称D3细胞数8-104-510碎片程度0%<10%10-25%26-49%>50%裂球对称------------------------稍不对称很不对称3、胚胎分级(由Ⅰ-Ⅳ胚胎质量下降)分级细胞大小细胞形态胞质碎片均匀规则均匀清晰无颗粒0-5%稍不均稍不规则可有颗粒10-20%Ⅲ级明显不均明显不规则明显颗粒21-50%Ⅳ级严重不均严重不规则严重颗粒>50%4、囊胚评分1)、囊胚(blastocyst)发育分期1期:earlyblastocyst囊胚腔小于胚胎总体积的1/22期:blastocyst囊胚腔大于胚胎总体积的1/23期:fullblastocyst囊胚腔完全占据了胚胎的总体积4期:expandedblastocyst囊胚腔完全充满胚胎,胚胎总体