扶正软坚和温肾助阳对甲减肾损害大鼠vegf表达及肾功能形态的影响

扶正软坚和温肾助阳对甲减肾损害大鼠vegf表达及肾功能形态的影响

甲减的病理基础是阴阳病。肾阴虚证是肾阳虚证的结果。它还可以出现粘膜混浊和止血引起的病理症状。临床主要表现:元气缺乏,气血不足,脏腑受损的阳虚证候。治则:肾虚为主,肾精不足是根本,肾阳不足是关键。病变又常涉及心脾两脏导致脾肾阳虚及心肾阳虚。甲减可围绕温肾助阳这一主线。另一方面甲状腺肿大为痰瘀,而软坚散结、化痰理气利水、活血化瘀等均可使用。具有温肾健脾作用的补中益气汤目前已应用于临床,具有扶正软坚用的芪贝复元饮对恢复甲状腺功能也有明显作用。但这些药物对恢复甲减的甲功与肾功能是否能达到同样的效果。VEGF在肾损害的发病中起的重要作用已被证实,VEGF在甲减肾损害的发病中起何作用,这些药物对甲减肾损害机体肾脏形态及VEGF的影响如何,这些都是尚未研究的问题。本实验以碘缺乏肾损害大鼠为模型观察上述二种药物对甲减肾损害的疗效,为指导临床用药提供实验依据。数据和方法1材料表面1.1具体的配方补中益气汤和芪贝复元饮粒组成、剂量及配伍分别参照《脾胃论》(黄芪、红参、当归、白术、炙甘草、升麻、柴胡、陈皮)、《太平惠民合剂局方》(太子参、生牡蛎、制鳖甲、夏枯草、黄芪、当归、柴胡、莪术、苏子、郁金、陈皮、浙贝母、法夏、连翘、独活)。其中药饮片购于辽宁中医药大学附属医院中草药局。1.2提供供应商提供物质保障普通饲料:由沈阳市于洪区前民实验动物饲料加工厂提供;低碘饲料:采用全国重度缺碘地区河北省承德市隆化县大两间房村饲料加工厂提供(碘含量为20.11μg/kg)。2方法2.1实验组模型制备方法4周龄清洁级Wistar大鼠64只,雌雄各半,体重(110±20)g(由中国医科大学实验动物中心提供),适应性饲养1周后,随机分为两组,正常组16只、实验组48只,实验组又随机分为模型组、补中益气汤组、芪贝复元饮组,每组各16只,正常组饲以双蒸馏水和普通饲料21d;实验组模型制备方法参照Kolaja法——饲以低碘饲料和1%高氯酸钠溶液(上海国药集团)19d,停用后续喂低碘饲料和双蒸馏水2d。各组均取8只留取尿样、血样标本以观测成模指标(按上述方法预实验已成模)。用药情况:正常组每日予2ml双蒸馏水灌服,继续饲以双蒸馏水和普通饲料56d;模型组(每日予2ml双蒸馏水灌服)、芪贝复元饮组(每日灌服2ml含生药量约为14.99g/kg的芪贝复元饮煎剂)、补中益气汤组(每日灌服2ml含生药量约为18.99g/kg的补中益气汤煎剂)、上述三组均饲以双蒸馏水和低碘饲料56d,各组均取8只留取尿样、血样标本以观测指标。2.2一般情况下对各组大鼠体重、饮食量、大便、行为表现等进行观察。2.3酶活力的测定(1)TT3、TT4及TSH的测定:TT3、TT4采用放免法(试剂盒由北京赛博润特科技发展中心提供);TSH采用ELISA法(试剂盒是美国RB公司提供)。(2)Scr、BUN测定:酶速率法(由日立1620全自动生化分析仪测定)。(3)尿碘测定(国标法)。(4)肾脏形态观察:PAS染色(长春赛默瑞特PAS糖原染色试剂盒)。(5)免疫组化检测肾脏VEGF表达水平(SP三步法):VEGF一抗、二抗(武汉博士徳生物技术有限公司提供),DAB显色剂(北京中杉生物科技有限公司提供)。3比较两组患者尿碘等t检验,总碘dms数据处理采用SPSS17.0软件进行统计分析,除尿碘以中位数(M)表示外,其余实验数据以(x¯±s)(x¯±s)表示,两组组间比较采用成组t检验,P<0.05差异有统计学意义。结果1大鼠肢体形态变化,主要表现为正常组大鼠体重逐渐递增,食欲好,大便正常,背毛光泽,反应灵活。实验组大鼠体重逐渐下降,食量和饮水量减少,尿量明显减少,大便干,对外界环境刺激反映淡漠。部分大鼠出现后颈部毛发脱落、稀疏。用药56d后各组体重均增加,尿量均明显回升,2个治疗组大鼠表现较模型组改善,其中反应以芪贝复元饮组最为灵活,该组大鼠于兴奋状态,体力恢复较好,补中益气汤组反应与正常组接近。2个用药组tsh、tt3、tt4及tsh比较处理21d时与正常组相比各实验组TT3、TT4明显降低,TSH明显升高,2个用药组间TT3、TT4及TSH无明显差异。用药56d时,与模型组相比2个用药组TT3、TT4均有明显恢复,TSH均低于模型组,但仍高于正常组。见表1。3造模成功与否分析21d成模时,与正常组相比各实验组血BUN及Scr均明显升高,各实验组间差异无统计学意义,提示甲减肾损害模型造模成功。用药56d后补中益气汤组血BUN及Scr与正常组比差异无统计学意义,芪贝复元饮组与正常组相比差异有统计学意义,与模型组比差异无统计学意义。见表1。4各组mui的尿碘比较处理21d及56d各组尿碘明显低于正常组。见表1。5积分光密度检测21d成模时随机选取正常组、实验组各8只(雌雄各4只),每例随机选取5个肾小球,用MataMorph显微图像分析系统放大400倍测定积分光密度(integratedopticaldensityaverage,IODA)(表示阳性物质的相对含量),实验组IODA明显高于正常组(44.64±14.99对29.05±9.14,P<0.01)。用药56d后,测定方法同上,与正常组相比模型组IODA下降,但差异无统计学意义,与模型组相比只有补中益气汤组IODA明显升高,与正常组相比仅芪贝复元饮组IODA小于正常组。见表1。6各组小鼠血清中系膜相关指标的变化21d成模时,与正常组相比模型组系膜细胞轻度增生,系膜区增宽,基质增多。用药56d后,与成模时相比模型组系膜中度增生,非增生区部分毛细血管扩张,各用药组均有轻中度增生,芪贝复元饮组增生最重,非增生区毛细血管腔增大,个别呈瘤样扩张,其内可见较多的红细胞,基底膜增厚,补中益气汤组增生最轻,毛细血管开放良好。见图1。7足细胞vegf表达21d成模时模型组VEGF表达明显升高,肾小球及肾小管表达较正常组增强。用药56d后正常VEGF主要表达于足细胞,近曲小管基底膜及刷状缘、集合管较足细胞表达稍强。模型组足细胞VEGF表达普遍减弱,肾小管表达区域减少。补中益气汤组足细胞VEGF表达明显增强,表达区域增多,内皮细胞及近曲小管也有表达,芪贝复元饮组足细胞无明显表达,肾小管有表达。见图2。正常组不同处理对足细胞vegf的影响国外研究报道慢性肾病(CKD)失去肾小球及肾小管间质血管床,VEGF表达下降,而提升VEGF对恢复血管床有利。本试验在用药56d后免疫组化染色可见补中益气汤组VEGF升高最明显,PAS染色见该组肾小球毛细血管开放数量最多,所以肾血流量多,因而肾小球滤过率高而肾功能恢复最好。可见补中益气汤对甲减肾损害的肾功能恢复的一个重要机制是通过升高VEGF恢复肾小球毛细血管床。目前研究发现甲减肾损伤与足细胞病变相关。VEGF主要由足细胞和小管上皮细胞表达,本实验结果与之相符,本实验还发现模型组及芪贝复元饮组在用药56d后VEGF下降低于正常组而芪贝复元饮组PAS染色毛细血管呈瘤样扩张,其内可见较多的红细胞,可能因为长期甲减由于静水压升高引起毛细血管襻突出而足细胞未能相应增殖和扩张,导致足细胞产生VEGF下降。芪贝复元饮的作用机制与补中益气汤不同,它是通过活血化瘀产生扩血管作用,增加肾血流量,从而恢复尿量,但扩张的同时可能没保护足细胞,本研究发现芪贝复元饮组肾小球基膜皱缩增厚,可能是由于足细胞足突减少所致,具体机制尚待进一步研究。从肾功能、甲功、肾脏形态几方面综合考虑补中益气汤均优于芪贝复元饮。脾气虚弱是碘缺乏致甲减肾损害大鼠的主要证候,而补中益气汤温肾健脾作用正是甲减的治疗方案,现代药理研究发现单用补中益气汤似有使受抑制的下丘脑-垂体-甲状腺轴功能恢复正常的作用,同时使TSH、T3、T4恢复正常水平,补中益气汤能减少小鼠运动后血尿素氮含量,加速运动后