伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体感染性多发性脑动脉病家系中的不典型病例分析

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体感染性多发性脑动脉病家系中的不典型病例分析

脑血管疾病是威胁人类健康的三种疾病之一。发病率仅占该病的一小部分（<10%）。皮质下动脉硬化疾病和白质脑病的常染色体显性脑动脉疾病（cerebolstatisticalco起源，omim125310）是近年来的热点。CADASIL多在中年发病,临床特征为反复发作的缺血性卒中、偏头痛、精神异常和皮质下痴呆。磁共振成像(MRI)检查示多灶性皮质下梗死及白质脑病。病理改变为脑深部多发的腔隙梗死和白质脑病,以及小动脉中层平滑肌细胞表面颗粒性电子致密嗜锇颗粒物质(GOM)的沉积。这些特征性的病理改变是诊断CADASIL的金标准。该病的遗传缺陷被定位于染色体19p13.2-13.1的NOTCH3基因上。迄今为止,国外已经报道了约400个家族,已经发现超过50种突变。最常见的突变位于第3和4外显子中。本病在高加索人种中患病较多,最近几年在我国和日本也有报道,我们最近收集到4个国内CADASIL家系,现报道他们的主要临床特点和基因检测的结果。对象和方法一、临床表现及临床症状4个先证者分别来自4个不同的家系,他们的临床表现、影像学改变以及病理结果均符合CADASIL的诊断。家系1、3祖籍山西,家系2祖籍黑龙江,家系4祖籍北京。家系图见图1,每个家系中患病成员的简况见表1。先证者1,男,38岁,自37岁起出现间断头晕、言语不清、走路不稳,并逐渐出现应答不切题,记忆力明显下降。既往有饮酒史15年。神经系统检查示记忆力尤其是近记忆力明显减退,计算力和理解力差,定向力尚可。四肢肌力正常,右下肢共济运动差,双侧病理征(-),家系图见1a。先证者2,女,47岁,44岁开始出现头晕,右侧上下肢无力,走路不稳,头颅CT显示多发性脑梗死,经治疗遗留右侧肢体稍力弱。此后因相似的症状复发3次住院治疗,并逐渐出现手足麻木。患者无高血压、高血脂、心脏病、糖尿病史。体格检查:构音障碍,计算力和近记忆力差,双眼向左、右及上视均可见眼球震颤。四肢末梢性痛觉减退,左上下肢轻瘫,左侧共济运动欠稳准。四肢腱反射活跃,双侧踝阵挛(+),四肢病理征(+),家系图见1b。先证者3,女,39岁,8个月前出现头晕伴恶心、呕吐,在外院诊断为“脑梗死”,治疗后头晕症状好转,此后间断头晕发作。3个月前,劳累后出现左头部胀痛,伴恶心。既往体健。入院后一般内科查体及神经系统检查未见异常,家系图见1c。先证者4,女,44岁,自41岁始出现反复发作性缺血性卒中,表现为发作性眩晕和/或左侧肢体无力,血压波动性升高3年。无冠心病和糖尿病史。近1年出现智力减退。有关这个家系的临床特点已作过报道,家系图见1d。4例先证者的脑MRI均可见双侧基底节、脑干等部位的多发性腔隙性低密度灶,以及脑室旁白质广泛脱髓鞘改变。对4例先证者进行腓肠神经活检,均发现小动脉壁平滑肌细胞变性,其表面出现大量的GOM。对先证者1同时进行腓肠肌活检,在肌纤维内发现线粒体内类结晶包涵体。二、pcr反应及测序1.盐析法提取患者外周血基因组DNA,酚/氯仿法提取肌肉组织基因组DNA。2.聚合酶链反应(PCR):引物覆盖了NOTCH3基因编码区的外显子1~12及其两旁的内含子序列(表2)。反应体系:25μlPCR反应体系中含引物各0.2μmol/L,dNTP各100μmol/L,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2+1.5mmol/L,0.1%TritonX-100,Taq酶1U,DNA模板50~100ng。PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸45s,共30个循环,最后1个循环于72℃延伸10min。反应结束后,以1.5%琼脂糖凝胶(内含0.5μg/ml的溴化乙啶)电泳检测PCR产物。3.PCR成功后,再扩增100μlPCR产物,纯化后,送北京奥科生物有限公司用ABI373型DNA全自动测序仪测序。对发现的突变再进行反向测序证实。tch3蛋白质突变PCR产物直接测序的结果证实4个先证者均存在NOTCH3基因的杂合性突变,且突变位点各不相同。先证者1、2和3的突变位于外显子3,分别为268C→T、322C→T和328C→T突变(核苷酸的位置从翻译起始密码子ATG的A算起),造成Notch3蛋白质的突变分别为R90C、C108R和R110C;先证者4的突变位于外显子11为1819C→T,造成R607C(图2)。这4种突变均经正、反向测序证实。因为先证者2的C108R突变为文献尚未报道的新的突变,此突变产生限制性内切酶NaeⅠ的新的酶切位点,故用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对50名正常人DNA进行突变筛查,均未发现有此突变。对家系2和4的部分成员也进行了NOTCH3基因的突变检查。先证者2的母亲(Ⅲ7)携有C108R突变;其哥(Ⅳ7)及其父亲表型正常,也无此突变;然而先证者之子(Ⅴ1)现年18岁,虽然表型正常,却携有C108R突变(图3)。在家系4中,先证者4的三姐(Ⅲ4)的头颅CT显示丘脑梗死,她也有杂合性的R607C突变;而先证者的五姐(Ⅲ6)无此突变也无本病的症状。h蛋白质受体家族这4例先证者均经过脑外组织活检发现小动脉平滑肌细胞的胞膜表面出现典型的GOM而证实CADASIL的诊断。对先证者及其亲属基因突变的检测发现,这4个CADASIL家系的患者中都有NOTCH3基因的杂合性突变,符合显性遗传的特征,从基因水平进一步证实了该病的诊断。这4个家系的突变各不相同,有3个家系位于外显子3,1个位于外显子11,所以外显子3也是中国CADASIL患者的突变热区。这4种突变中R90C、R110C和R607C已被报道,C108R则为新的突变类型,前3种基因突变使碱性氨基酸的精氨酸变为含硫氨基酸的半胱氨酸,而第4种突变则造成半胱氨酸替换为精氨酸,所以这4种突变均导致蛋白质的性质发生很大的改变,即它们都是致病性的突变,由此引起这4个家系中的CADASIL。NOTCH3基因编码一种兼有受体和信号传导功能的跨膜蛋白质,属于NOTCH蛋白质受体家族的一员,进化上高度保守,结构上可以分为胞外的34个表皮生长因子样重复序列和胞浆中的6个锚蛋白重复序列,前者与配体结合,后者介导细胞内的信号传导,在细胞分化中起着重要作用。报道的已超过50种突变。95%为错义突变,绝大部分与半胱氨酸有关,突变造成一个半胱氨酸改为其他氨基酸,或者其他氨基酸变为半胱氨酸,这与我们报道的结果一致。这些突变均发生于表皮生长因子样重复序列内,半胱氨酸残基的产生或丢失导致表皮生长因子样重复序列内产生奇数的半胱氨酸残基,打破了原有正常的二硫键的形成,改变了蛋白质的构象,影响受体-配体之间的相互作用;或者导致同型二聚体或异型二聚体在血管平滑肌细胞内的堆积,造成血管平滑肌细胞的变性。Notch信号传导通路还与线粒体呼吸链的电子传递有关,在先证者1的肌纤维内发现线粒体结构的异常,提示Notch3蛋白质的突变可能影响线粒体的功能。这4个家系的患者中,缺血性脑血管病都主要累及椎基底动脉系统(选择性的后循环受累),智能损害较早而且突出,个别成员仅表现为进行性痴呆。亚洲其他国家报道的患者也是以卒中和痴呆为主要的临床表现,缺乏偏头痛,这与欧美国家报道的临床表现不完全相同。这些临床表现规律在种族之间的差异可能不是NOTCH3突变类型不同造成的。因为,首先我们报道的这4个家系,有3个家系的突变类型与其他文献报道的相同;其次,这4个家族虽然存在NOTCH3基因的不同位点突变,但临床表现相似。所以,我们推测其他基因也可能影响该病的临床表型。NOTCH3基因在CADASIL的发病过程中的重要性已经得到公认,但是其确切的发病机制至今尚未明确。在成人,Notch3受体特异性表达于血管平滑肌细胞,而NOTCH3基因突变不影响Notch3的表达和蛋白质裂解,这说明基因突变所致的血管平滑肌细胞的变性可能在CADASIL的发病机制中起重要作用。免疫组织化学方法证实CADASIL患者的Notch3受体细胞外片段在血管平滑肌细胞膜上出现大量聚积,与GOM邻近但并不在GOM内。CADASIL平滑肌的改变和其他脑小动脉病(脑类淀粉血管病、Binswanger病)一样,最后导致脑小血管玻璃样变性和胶原纤维成分的改变以及血管活性的下降,血液动