鼠源单克隆抗体的研究进展

鼠源单克隆抗体的研究进展

自混合肿瘤技术的诞生以来，单克隆抗体对人类疾病的研究起到了重要的推动作用。目前,针对各种物质的鼠源单克隆抗体已经非常普遍。但鼠源单克隆抗体用于疾病的治疗时却有严重的不足,例如:血清中半寿期短;仅有部分不同亚类的抗体能引发效应功能;最大的障碍是诱发人抗鼠(HAMA)反应。随着抗体工程的发展,利用抗体技术对鼠源抗体进行人源化改造是解决治疗用单克隆抗体的有效途径。尤其是近年来由于抗体库技术的快速发展,纯粹的人源抗体也可以通过基因工程手段获得,这可能是未来治疗用单克隆抗体的主流。因此笔者就单克隆抗体人源化的有关实验研究进展进行了综述。1mcab的人源化克服HAMA反应的2种可能的方法就是使用人源抗体或人源化抗体。由于特异性强、亲和力高的人源抗体的基因不易得到,目前主要进行鼠单克隆抗体McAb的人源化。该方法就是在消除鼠源McAb的对人的免疫原性前提下而将其进行改造,使之和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓(profile),从而逃避人免疫系统的识别,避免诱导HAMA反应。进行抗体的人源化时应遵循2个基本原则,即保持或提高抗体的亲和力和特异性;大大降低或基本消除抗体的免疫原性。目前,虽然人源化有多种方案,但都必须遵循这2个原则,尤其不能丧失抗体特异结合的能力。2大鼠mca的源化方法2.1鼠单抗的恒常性检测抗体的恒定区不仅是决定抗体免疫效应功能的关键部位,而且是抗体在体内保持较长的半衰期的主要原因。人体中的多数蛋白质分子的半衰期都很短,而抗体分子在体内却相当稳定,尤其是IgG(除IgG3之外),其半衰期多达20d,这主要是由于许多组织的细胞表面表达一种IgGFc受体FcγRn,该受体具有调节IgG代谢的作用(该受体的另外一种功能是介导IgG通过胎盘)。当完整抗体IgG与细胞表面的受体FcγRn结合时,就可以免受循环中的蛋白酶等酶类的降解。抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性最强的部位,而决定抗体特异性的是抗体的可变区,且引起人抗鼠抗体反应主要由鼠单抗的恒定区所致,运用基因工程技术将鼠单抗可变区与人抗体的恒定区相拼接,即成为鼠单抗人源化的最简单形式人/鼠嵌合抗体(chimericantibody)。在嵌合抗体中仅有可变区为鼠源性,大大降低了鼠源单抗的免疫原性,同时又保留了鼠单抗的高亲和性及特异性。因此通过基因工程的手段将鼠源单克隆抗体的恒定区置换为人源抗体的恒定区可大大降低抗体在人体应用中的HAMA反应。实验表明,嵌合抗体既具有鼠源单克隆抗体的特异性抗原结合能力,又具有人源抗体的免疫介导功能。目前产生嵌合抗体的技术路线比较成熟,现已有多种嵌合抗体被研制出来,部分已作为治疗性药物进入临床。但由于嵌合抗体保留的鼠源序列较多,在进行临床试用时能够被人体的免疫系统所识别产生HAMA。如Khazaeli等研究发现,重复给予嵌合抗体B72.3后,12名肠癌患者中的7人引发针对鼠源可变区的人抗鼠抗体反应。故有必要对鼠单抗可变区进行进一步的人源化。2.2改革共线的抗2.2.1人、鼠间抗体可变区残基的同源模建对鼠CDR及FR表面残基进行镶饰或重塑,以使之类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的型式。表面重塑途径的一个前提是,鼠McAb可变区的免疫原性起源于它的表面残基。因为现在普遍认为,残基的运动性和溶剂的可及性是其成为抗原决定簇的基本条件,因此表面残基理应携带绝大部分(如果不是全部)的抗原表位。溶液可及性表面残基的划分标准是,构成该残基的全部原子的30%以上是溶剂可及的。尽管人、鼠间抗体可变区表面暴露残基的精确型式有差别,但大多数的表面位置的残基类别有强烈的倾向性,仅仅考虑这种表面型式就可分出抗体可变区的组别。这说明抗体可变区表面至少也和框架区核心一样保守,表面型式的差别是人鼠间抗体的主要差别。根据对现有的抗体晶体结构数据的分析结果统计,在序列配对位置上,人、鼠间抗体可变区残基的相对溶剂可及性分布的保真度达98%。这说明在异种间诱导免疫反应的残基是由其余的种特异性溶液可及表面残基引起的。将鼠特异性表面残基换成人源性的,就可模拟人源抗体的表面轮廓,逃避人体免疫系统的识别,达到人源化的目的。该策略可以不进行同源模建,在序列同源分析的基础上,选择与鼠表面残基暴露类型最相匹配的人源型式进行,但不够准确。另外,如果要改变的残基在侧链大小、电荷、疏水性,或有可能形成氢键从而影响到CDR的构象,则不予改变。因为要改变的残基较少,能减少CDR-FR之间的不相容性。鼠源McAb在人体引起的HAMA反应,究竟是完全由其表面的暴露残基引起,还是由表面残基与内部残基的共同贡献,涉及到抗体产生最基本的免疫学机制,而这种机制仍是目前探讨的热点。尽管有人认为即使在MHC背景下鼠源McAb被加工和提呈后包埋残基暴露出抗原性,但诱生的抗抗体也只能和降解的或解折叠的原抗体起反应,不会干扰原抗体的治疗效应。2.2.2cdr残基的替代在人FR选择与CDR有相互作用、与抗体的亲和力有密切关系或对FR空间结构折叠起关键作用的残基进行改变,以补偿完全的CDR移植。立体结构数据和同源性分析表明:从抗原结合、稳定CDR构象、FR折叠这几个方面而言,构成抗体FR的残基并不具有相同的重要性。以此为依据将这些残基分成3类:①低风险性残基,即暴露于溶剂而对抗原结合和抗体结构贡献甚少的残基。替代这些位置的残基能降低免疫原性而几乎不影响抗体的亲和力。②高风险性残基,即直接参与抗原结合、稳定CDR构象或FR折叠的残基。为了保持人源化抗体的活性,应尽量避免在这些位置进行替换。③中度风险性(Moderate-risk)残基。FR中的高风险性残基和某些中度风险性残基,通称为非CDR区补充调控残基。它们散布于线性序列的不同位置,为每个CDR回折(Loop)提供了合适的“平台”。其形状和侧链大小协同决定CDR的基本构象,并影响其抗原结合的特异性。因而将CDR搬到人源FR后,必须将人FR中的这些位置替换成鼠源非CDR区补充调控残基以补偿完全的CDR移植。这种分析方法使人源化突变方案具有选择性和针对性,避免了盲目的可能导致失败的探索。通过在中度风险性残基中进行变化,还有可能提高人源化抗体的亲和力。不足的是对残基的分类要以晶体数据和三维结构为基础,才能提供准确的标准。2.2.3在最简位置模板的选择上进行人源化人源化McAb保留了鼠源McAb可变区中参与抗原结合的氨基酸残基,包括CDR和FR中的一些关键残基。尽管鼠框架区的其余部分可以从某个人FR中搬移过来,毫无疑问,这样得到的人源化抗体序列和人抗体的保守序列(Consensusse-quences)在一些位置上有差别。这些来源于个体型抗体亲和力成熟过程中体细胞突变的非典型残基,应用于病人后会诱导免疫反应。因此,理想的途径是,以人FR保守序列为模板进行人源化。由于人抗体轻、重链可变区不同亚类的保守序列并不相同,需要一种合适的方法来寻找最适保守序列。最简位置模板(Minimalpositionaltemplate)表明,抗体可变区中哪些位置绝对需要保持抗体的抗原结合结构域的完整性,提供了确定关键位置的方法。在选择人框架区时,首先从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠框架区最类似的序列;其次根据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基;最后保留所有这些位置而将其余部分进行人源化。Couto等首先利用计算机模建和实验探索找到一个最简模板。以此模板对抗乳腺表皮抗原BA46的抗体Mc3成功地进行了人源化。2.3采用氨基乙烯技术对大鼠进行抗人源化噬菌体抗体库技术的问世,为鼠单抗的人源化提供了新的方法。由于抗体库具有对多样化抗体的强大筛选能力,可以从2方面用于鼠单抗的人源化。2.3.1人源化抗体的筛选在进行抗体人源化过程中,除移植CDR外,还需移植部分在抗原结合过程中起重要作用的骨架区的残基。尽管通过立体构象分析和分子模建有助于这些骨架区残基的确定,但其最终的确定往往需要构建多种抗体的突变体,反复测试。用抗体库方法可在候选骨架区残基的位置同时引入鼠源副本及人源副本,构建组合抗体库,通过高效筛选过程寻找最佳组合,获得高亲和力的人源化抗体。Baca等在对抗VEGF鼠单抗进行人源化时发现,单纯CDR移植获得的人源化抗体的亲和力与相应的嵌合抗体相比,降低了4000倍。进一步分析发现骨架区中13个残基可能在抗原结合过程中起重要作用。将这13个残基进行随机化后构建噬菌体抗体库,通过8轮筛选获得了亲和力提高125倍的人源化抗体。2.3.2基于人源可变区基因库配对的人源抗体筛选这是在噬菌体抗体库技术基础上发展起来的新的鼠单抗人源化策略,1994年由Jespers等首先提出。其基本原理是以鼠单抗为模板,利用噬菌体表面选择体系,筛选出与亲本鼠单抗识别相同抗原表位的完全人源抗体。基本要点为:克隆鼠单抗基因,以鼠单抗轻链或重链可变区基因与多样性的人重链或轻链库基因组合,形成杂合抗体库,用相应的抗原从中筛选有结合活性的人—鼠杂合抗体,再用杂合抗体中的人源可变区基因与另一条链的人源可变区基因库配对,筛选出完整的人可变区基因。该方法操作简单,能够获得完全人源抗体。王卓智等曾运用该方法对抗TNF-α鼠单抗进行人源化,虽获初步成功,但也体会到由于完全脱离鼠单抗的基因序列,所获人源单抗的特异性和亲和力难以得到保证,甚至有时所获的人源抗体与抗原的结合活性会产生漂移,与亲本鼠单抗有所不同。为此,Rader等对该方法进行了改良,在抗原定向选择方法中,以亲本鼠单抗的CDR3区基因替换所用的人抗体库中的CDR3,构建了含亲本鼠单抗CDR3基因的人源化噬菌体抗体库,再通过与鼠单抗亲本抗体配对,依次进行链替换,筛选到与亲本鼠单抗识别同一抗原表位的抗人整合素αγβ3人源抗体。由于CDR3区是决定抗体特异性的关键部位,其巨大的多样性使本身不具有明显的种属特异性,通过引入鼠单抗CDR3序列,可在不影响其人源性的情况下增加其模拟亲本鼠单抗的能力,更易于筛选到与亲本鼠单抗识别同一抗原表位的人源抗体。因此CDR3导引的抗原表位定向选择法进行鼠单抗人源化可能成为一种有效的方法,但该方法能否普遍应用,有待进一步验证。3vifigin在实体瘤治疗前的临床试验近几年美国FDA批准的新药中,工程抗体占很大比例,目前已有100多种人源化单抗进行了临床试验,其中数十种抗体相关新药得到了应用,其中MedImmune公司研制的抗-αγβ3人源化抗体Vitaxin在治疗