大鼠丘脑束旁核神经元

大鼠丘脑束旁核神经元

心悸是缺血性心脏病（ihs）的一个重要临床症状。由于心肌缺血引发的心绞痛(症状)和急性心肌梗死(损伤)的程度往往不相平行,且目前对心绞痛的研究多是从急性心肌缺血时疼痛产生和传导机制方面入手的,对于疼痛本身在急性心肌缺血时心肌损伤病理生理进程中的作用和地位的研究尚有限。阿片受体是介导内源性阿片肽及阿片类药物作用的受体,其中μ1-阿片受体(μ1-opioidreceptor)亚型在痛觉调制中起重要作用。丘脑束旁核(parafascicularnucleus,Pf)是内脏痛觉重要的整合中枢,具有广泛的神经纤维联系,其内含有丰富的阿片能神经末梢及其受体。以往对Pf的研究多采用神经电生理的方法,用原位杂交的方法来研究心肌缺血不同时点大鼠Pf神经元μ1-阿片受体mRNA表达的变化鲜有报道。本实验旨在采用原位杂交技术来研究急性心肌缺血时大鼠Pf神经元μ1-阿片受体mRNA表达的变化,以探讨在急性心肌缺血伤害性刺激作用下,大鼠Pf中μ1-阿片受体在痛觉调制中所起的作用及机制。材料和方法1.冠状动脉前降支的制备采用健康成年雄性SD大鼠36只(山西医科大学实验动物中心提供),体重260～280g。随机平均分为两组:对照组(non-coronaryarteryocclusion,C组)、扎闭冠脉(coronaryarteryocclusion,CAO)组。每组又分为1h、3h和6h三个不同时点的亚组。将动物麻醉(25%乌拉坦1.2g·kg-1,i.p.)后行气管切开,控制呼吸(RR75次/min,VT8ml·kg-1)。在左胸骨旁第4～5肋间作1cm长切口,暴露心脏,剪开心包膜后用7～0无损伤缝线结扎冠状动脉左前降支(对照组动物仅在冠状动脉下穿线,不结扎),并计时。然后逐层关胸,行胸腔负压引流后,解除人工通气,动物恢复自主呼吸。术中每小时经尾静脉补给林格式液1ml。所有手术切口均用0.125%布比卡因施以局部麻醉,总量不超过1ml。2.脑块沉底、固定开胸经主动脉根部灌注4℃4%多聚甲醛固定液300ml,取脑,把含有Pf的脑块置于前述固定液中后固定10min;然后入4℃30%蔗糖(0.1mol/LPBS配置)中过夜至脑块沉底。然后用恒冷箱切片机(LeicaCM-1850,德国Leica公司)行15μm厚冠状冰冻连续切片,室温下空气中风干,-70℃保存。3.u3000试剂杂交前,室温平衡,孵育在2×SSC5min×2;切片入新鲜配制的0.3%H2O2的甲醇溶液中灭活内源性的过氧化物酶,室温下30min,双蒸水洗涤3次;切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶以暴露mRNA核酸片段,37℃120秒钟,原位杂交用PBS(0.5MPBS)冲洗5min×3,双蒸水洗1次;每张切片滴加20μl预杂交液,恒温箱内孵育3小时,吸去多余液体,不洗;每张切片滴加20μl杂交液,加盖原位杂交专用盖玻片,37℃恒温箱内杂交12h,揭掉盖玻片,2×SSC洗涤5min×2,0.5×SSC洗涤15min×1,0.2×SSC洗涤15min×1;滴加封闭液,37℃30min,吸去多余液体,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60min,0.5MPBS冲洗5min×4;滴加SABC,37℃20min,0.5MPBS冲洗5min×3;滴加生物素化过氧化物酶,37℃20min,0.5MPBS冲洗5min×4;DAB显色,镜下适时终止,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性塑胶封片。每一组均设立试剂(阴性)对照(未使用μ1-阿片受体mRNA抗体)。μ1-阿片受体mRNA原位杂交检测试剂盒、原位杂交专用盖玻片、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司,DEPC购自Sigma公司。4.小鼠骨髓1-阿片受体mrna的半定量分析用BX51-型Olympus光学显微镜高倍镜下(×400)结合IDA-2000数码显微图像分析系统(中科院北京空海科技发展有限公司)对Pf部位μ1-阿片受体mRNA染色阳性的细胞进行半定量分析,分析指标选用平均光度、积分光度、阳性面积和阳性单位。每张切片随机分析Pf部位的七个视野。5.双因素方差分析所有数据均用X¯¯¯±SX¯±S表示,采用SAS8.0统计软件包行双因素方差分析,进行同一时点不同组间和同一组内不同时点的两两比较。如果方差齐,采用LSD法;如果方差不齐,则采用Games-Howell法。检验水准取α=0.05,P<0.05认为差异有显著性。心肌缺血引发的心脏伤害性刺激信号--丘脑神经网络束的表达原位杂交结果:组织切片背底清晰,对照组各组中有染色阳性神经元无规律地零星、散在分布,胞浆不着色或轻度着色,胞核浅淡,神经元形态不规则,略显模糊,细胞突起少。而CAO组大鼠Pf部位(图1)μ1-阿片受体mRNA染色阳性神经元显著增加,呈不对称散在分布,神经元形态多样,轮廓清晰,细胞突起较多,胞浆呈棕黄色,胞核不着色或轻度着色(图2A、2B)。扎闭冠脉1h、3h、6h后Pf部位棕黄色阳性表达颗粒逐渐增多,而对照组各时点比较则差异不明显。统计结果:上述指标在分组因素和时点因素间均有统计学意义,并且分组和时点具有交互作用。同一时点不同组间和同一组内不同时点两两比较结果显示:在各相应时点(1h、3h和6h),CAO与对照组相比均有显著性差异(P<0.05);在同一组内(CAO和对照组),CAO后的各时点之间比较差异均有显著性(P<0.05),而对照组各时点间比较差异无显著性(P>0.05)。CAO后大鼠Pf神经元μ1-阿片受体mRNA表达显著增加,且随着缺血时间延长有逐渐增加的趋势(见图3)。疼痛是一种复杂的生理、心理活动,它往往与自主神经活动、运动反射、心理和情绪反应交织在一起,它不是简单地与躯体某一部分的变化有关,也不是由神经系统某个单一的传导束、神经核团和神经递质进行传递,疼痛刺激信号的产生、传导和感受始终伴随着复杂的神经活动,并且始终处于机体自身的调制之中。心肌缺血引发的心脏伤害性刺激信号的传导主要始于各种化学介质对心脏化学感受器的共同致敏,机械刺激也有可能在激活冠状动脉伤害性感受器的过程中发挥一定的作用。伤害性冲动通过交感神经脊髓背角和脊髓丘脑束到达侧部丘脑的腹后外侧核和中部丘脑的中央外侧核和中央中核-丘脑束旁核复合体,迷走神经也从孤束核发出最终到达丘脑后腹核,发挥一定的作用。PET研究发现,心肌缺血患者的脑血流量在双侧下丘脑明显增多,并且当心绞痛与缺血的心电图变化消失时,丘脑的活动仍然持续,与心肌缺血后持续性代谢紊乱相一致。人类的研究也说明心绞痛能够兴奋丘脑的核团,这提示丘脑是心绞痛产生的重要中枢神经结构。丘脑束旁核(Pf)属于丘脑髓板内核群,它接受脊-网-丘脑束的大量投射,不仅对内脏伤害性刺激发生反应,而且是内脏和躯体伤害性刺激的共同整合中枢,其内含有丰富的阿片能神经末梢及其受体。阿片受体属于G蛋白偶联受体,包括μ、κ、δ、ζ、ε等多种亚型,其广泛作用于中枢神经系统和循环系统。μ-阿片受体又分为μ1、μ2等七种亚型,其中μ1-亚型与吗啡的镇痛作用有关,其在痛觉调制中起主要作用。研究发现,敲除μ基因的小鼠,给予吗啡不能发挥抗伤害的功效。μ阿片受体主要分布于丘脑、中脑导水管周围灰质(PAG)、黑质以及脊髓等脑内与痛觉感受和镇痛有关的脑区,其中PAG是μ-受体介导阿片抑制疼痛下行神经传导通路的主要解剖位点。Northern印迹法表明大鼠μ-受体mRNA在中脑和下丘脑表达最多,并且在丘脑,μ-阿片受体mRNA和μ-受体的分布相当一致。在脊髓及脊髓以上部位注射μ-阿片受体激动剂可引起对各种实验性疼痛的镇痛作用。放射受体自显影研究表明,针刺能对中枢神经系统与镇痛有关脑区的μ-阿片受体产生上行性调节作用,5-HT释放剂芬氟明可使之进一步增加。研究表明,阿片受体是功能性的,外周炎症刺激能诱导中枢和外周神经末梢μ-阿片受体上调,福尔马林致痛提高大鼠尾核头部、杏仁核、中央灰质、脊髓背角等脑区的μ-阿片受体密度;另一方面,激活各种类型的阿片受体,包括μ-阿片受体,能够减轻大鼠后爪注射弗氏佐剂所引起的炎性疼痛。以上研究均表明伤害性刺激可以激活体内的阿片肽能活性,导致阿片受体合成增加,从而减弱机体对伤害性感受的易化作用,维持机体自身的平衡。反之,脊髓背角表层抑制性神经元凋亡,阿片μ-受体下降将明显有利于伤害感受信号的传递。本实验中观察到CAO后