沃尼妙林衍生物的研究与应用

沃尼妙林衍生物的研究与应用

瓦尔尼坦是新一代半合成抗生素（二级甲基丙烯酸酯），属于烯基酯，是泰明素的类似药物。1984年,瑞士Sandoz公司Bemer等利用截短侧耳素率先合成成功。1999年,瑞士Norvatis公司将其做成预混剂,商品名Econor,现已在多个国家上市,主要用于防治畜禽支原体及肠道螺旋体感染。由于沃尼妙林具有安全、高效、低毒、不易产生耐药性等特点,目前许多国家已广泛使用。本文就该药相关研究情况作一综述。1化合物3a5的合成现已上市的沃尼妙林原料药为盐酸沃尼妙林,化学名为{[2-((R)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-1,1-二甲基乙基]巯基}乙酸(3aS,4R,5S,6S,8R,9R,9aR,10R)-八氢-5,8-二羟基-4,6,9,10-四甲基-6-乙烯基-3a,9-丙烷-3aH-环戊环辛烯-1(4H)-酮-8-酯盐酸盐,分子式C31H53ClN2O5S,相对分子量601.30。其化学结构式为:盐酸沃尼妙林为白色或淡黄色非结晶性粉末,有吸湿性;在水、无水乙醇中易溶,在叔丁基甲醚中几乎不溶。比旋度为+15.5°～+18.0°,熔点174～177℃,pH值为3.0～6.0。2抑制蛋白质的合成沃尼妙林的作用机理是与病原微生物核糖体上的50s亚基结合,抑制其蛋白质的合成。Poulsen等研究发现,沃尼妙林可与病原微生物核糖体23sRNA的V区结合,阻止转肽酶在tRNA的CCA一末端的准确定位,从而抑制病原微生物蛋白质的合成,致使其死亡。3中毒和中毒3.1单种抗菌药物对猪瞳孔结构的感染,主要表现为外受沃尼妙林的mic295作为一种新型动物专用抗生素,沃尼妙林抗菌谱广,对G+、G-和支原体菌均有作用,对葡萄球菌、链球菌、猪肺炎支原体、猪滑液支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪痢疾短螺旋体、结肠菌毛样短螺旋体、细胞内劳森菌等均有较强的抑制作用,特别是对支原体属和螺旋体属高度敏感。Stipkovits等采用沃尼妙林、替米考星、克林霉素、金霉素及由青霉素、金霉素与磺胺二甲嘧啶组成的复方制剂对猪肺炎支原体、出血性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌感染的猪进行治疗,以其肺损伤为考察指标,结果发现沃尼妙林对由上述三种细菌感染的猪的肺损伤最小,表明沃尼妙林对上述三种细菌感染的呼吸道疾病疗效好于替米考星、克林霉素、金霉素及由青霉素、金霉素与磺胺二甲嘧啶组成的复方制剂。Hannan等报道,沃尼妙林对猪肺炎支原体的MIC90为0.0005μg/ml,是泰妙菌素的100倍,恩诺沙星的20倍;沃尼妙林对猪滑液支原体的MIC值为0.0001～0.00025μg/ml,是泰妙菌素的20～25倍,恩诺沙星的400～500倍。Karlsson等将从澳大利亚分离的76株猪痢疾短螺旋体进行不同抗生素对比抑菌试验,结果显示:沃尼妙林最敏感,其MIC90(mg/L)为0.5,而泰妙菌素为1,泰乐菌素大于256,红霉素大于256,林可霉素为64,克林霉素为16,说明沃尼妙林能更有效地抑制猪痢疾短螺旋体的生长。Jordan等分别对沃尼妙林、泰妙菌素、泰乐菌素、恩诺沙星及林可/壮观霉素进行鸡败血性支原体的最小抑菌试验,结果表明:沃尼妙林对鸡败血性支原体的抑菌作用最强(<0.008μg/ml)。Stipkovits等对犊牛进行人工感染牛支原体,并采用沃尼妙林和恩诺沙星对其进行治疗性试验,结果发现,与恩诺沙星比较而言,沃尼妙林能更快地缓解犊牛的发病症状,清除病原体,有效减少牛支原体对犊牛机体造成的损伤。Kinyon等报道,沃尼妙林对结肠菌毛样短螺旋体的MIC50为0.06μg/ml,MIC90为0.5μg/ml,而泰妙菌素的MIC50、MIC90分别为0.125μg/ml、1.0μg/ml,泰妙菌素的MIC50、MIC90分别为0.125μg/ml、1.0μg/ml,林可霉素的MIC50、MIC90分别为32μg/ml、64μg/ml,泰乐菌素的MIC50、MIC90均大于512μg/ml,说明结肠菌毛样短螺旋体对沃尼妙林更敏感。Wattanaphansak等分别采用卡巴氧、金霉素、林可霉素、泰妙菌素、泰乐菌素、沃尼妙林对从北美和欧洲分离的10株细胞内劳森菌进行体外抑菌试验,结果发现,卡巴氧、泰妙菌素、沃尼妙林的细胞内抗菌活性最强,其MIC99均小于等于0.5μg/ml;同时,沃尼妙林的细胞外抗菌活性最强,其MIC99为0.125～4μg/ml,表明沃尼妙林对细胞内劳森菌的抑制效果优于卡巴氧、金霉素、林可霉素、泰妙菌素、泰乐菌素。3.2中毒的研究3.2.1g体重对猪的急性毒性试验沃尼妙林毒性很低,按其活性物质计,大鼠的口服半数致死量(LD50)在1000～2000mg/kg体重,雄、雌小鼠的LD50分别是1710mg/kg体重、1482mg/kg体重;给猪每天拌料饲喂75mg/kg体重的沃尼妙林,连用28d,结果猪的体重正常,健康良好、粪便无异常,未观察到任何毒性反应;其它特殊毒性实验表明,沃尼妙林无“致畸、致癌、致突变”三致作用,同时对免疫系统、繁殖系统无任何影响。3.2.2沃尼妙林原型药物的安全性诺华公司研究人员发现:沃尼妙林以代谢物形式排出的量不超过给药量的20%。根据CVMP准则要求,考察沃尼妙林对环境的风险,只需考察其原型药物对环境的风险。然而,经其主要排泄途径(粪便)排出的沃尼妙林原型药物也不超过给药量的0.2%,说明动物采食沃尼妙林后大部分均被机体吸收,极少部分以原型药物排出体外。Boxall等以沃尼妙林原型药物为研究对象,对其的环境风险进行了一系列预测评估实验,结果表明,沃尼妙林不存在环境风险。4药代动力学研究4.1药动学特征检测EMEA(欧洲药品评价局)报道,对小猎犬按10mg/kg和30mg/kg体重剂量进行饲喂,3mg/kg体重剂量进行静注;对斯普拉-道来(氏)大鼠20mg/kg体重剂量进行饲喂,约6mg/kg体重剂量进行静注,采用3H-标记沃尼妙林上的半体乙烯基,研究其药动学特征。两群动物在饲喂给药后均迅速吸收,生物利用度达100%。在饲喂大鼠3h后,可在其肺部、肝脏和胃肠道检测到高浓度药物。在大鼠血浆、肝脏、尿液及粪便中用放射HPLC法可检测到22种不同的代谢物,不同动物间的代谢物存在很大差异。每天按30mg/kg体重剂量对狗进行饲喂,连续7d,在停药2h后剖杀,可在其肝脏和胆汁中检测到高浓度药物。在饲喂和静注给药后,药物及其代谢物主要以粪便形式排泄。4.2药代动力学及药时曲线下面积沃尼妙林在猪体内吸收迅速,分布广泛,其中主要分布在肝脏、肾脏;沃尼妙林排泄也非常迅速,主要是通过粪便,其次是胆汁排泄,尿液排泄仅占3%左右。EMEA研究报道,猪口服沃尼妙林吸收率大于90%,给药后1～4h达到最高血药浓度,血浆半衰期为1.3～2.7h。猪单剂量口服给药10mg/kg体重后,达峰时间(tmax)为1.85h,达峰浓度(Cmax)为1.29μg/ml,药时曲线下面积(AUC)为5.58μg/ml·h;当剂量为25mg/kg体重时,tmax、Cmax、AUC相应增加到2.9h、2.67μg/ml和18.23μg/ml·h;若继续增大剂量到50mg/kg体重,tmax、Cmax、AUC则相应增至4.15h、6.23μg/ml和67.3μg/ml·h。若2次/d以5mg/kg体重重复给药,则血浆浓度可维持稳定水平7.5d。另给15头猪分别口服5mg/kg体重的3H标记的沃尼妙林,2次/d,连用7.5d。停药第2d发现,92%的放射性物质在肝脏中,平均浓度为3650μg/kg;6%在肾脏中,平均浓度为240μg/kg;仅有2%在肌肉中,平均浓度为70μg/kg;皮肤和脂肪中则未检出。停药第8d,肝脏中放射性物质浓度为400μg/kg,肾脏中为20μg/kg,肌肉中未检出。5细菌mic的变化EMEA报道,用沃尼妙林、泰妙菌素、泰乐菌素、土霉素和恩诺沙星测定了猪肺炎支原体两个分离株的MIC值,结果显示:沃尼妙林对传代前培养细菌的MIC分别为0.0025μg/ml和0.001μg/ml,经10次传代后细菌的MIC分别变为0.005μg/ml和0.0025μg/ml,泰妙菌素耐药性变化不明显;相比之下,5～7次传代后猪肺炎支原体对恩诺沙星产生了20～100倍耐药性,对泰乐菌素产生了至少200～500倍耐药性,对土霉素产生了4倍耐药性,说明猪肺炎支原体不易对沃尼妙林产生耐药性。Karlsson等报道,沃尼妙林与泰妙菌素对猪痢疾短螺旋体与结肠菌毛样短螺旋体的体外抑菌试验表明,当猪痢疾短螺旋体与结肠菌毛样短螺旋体对泰妙菌素产生耐药性时,对沃尼妙林依然敏感,表明与泰妙菌素相比,沃尼妙林更不易使猪痢疾短螺旋体与结肠菌毛样短螺旋体对其产生耐药性。6沃尼妙林在猪体内的残留EMEA规定了沃尼妙林在猪体内的最大残留限量(MRLs):肝脏,500μg/kg;肾脏,100μg/kg;肌肉,50μg/kg。EMEA报道,给25头14周龄猪每天饲喂剂量为100mg/kg体重(相当于5mg沃尼妙林/kg体重)或300mg/kg体重(相当于15mg沃尼妙林/kg体重)的10%沃尼妙林预混剂,1次/2d,连用28d。采用HPLC法分析肌肉、肝、肾、带脂皮肤和血浆样品中沃尼妙林残留量,其最高残留量在动物肝脏中:8h后平均残留量为455μg/kg,1d后为113μg/kg,3d后低于定量限(25μg/kg);肾中平均残留量分别为94μg/kg(8h后),63μg/kg(1d后),111μg/kg(2d后),3d后低于定量限(25μg/kg);肌肉中平均浓度在休药8h后为33μg/kg,在第3d下降到定量限以下(25μg/kg)。实验期内,皮肤和脂肪的所有检测数据均低于定量限。EMEA另一研究报道,采用35头约3月龄的大白杂交猪,另取5头(3公2母)设为空白对照组,按2次/d给以10%沃尼妙林预混剂(含活性物10.5mg/kg体重·d),连喂21d,停药2h后,检测到1个带脂皮肤样品中沃尼妙林残留量为29μg/kg,其它的所有带脂皮肤样品及肌肉样品都低于定量限(25μg/kg);同时检测到1个肾脏样品的平均残留量为42μg/kg,低于设定的100μg/kg的最高残留限量(MRL),其他的所有肾脏样品都低于定量限。肝脏中的平均残留量从停药2h的1889μg/kg降到停药1d的49μg/kg,有1个肝脏样品在停药后2d残留量为33μg/kg,所有其他肝脏样品都低于定量限,停药后1d所有的肝脏样品都明显地低于EMEA规定的猪肝中的最高残留限量(500μg/kg)。上述资料均显示,沃尼妙林在猪体内消除很快,残留低。根据以上研究结果,可以确定沃尼妙林的休药期为1d。7善西恶意病的预防1999年,欧共体批准沃尼妙林上市,用于预防与治疗由猪痢疾短螺旋体感染引起的猪痢疾和由猪肺炎支原体引起的猪地方性肺炎。2004年,欧共体又批准增加了沃尼妙林的两个新适应症,由结肠菌毛样短螺旋体引发的猪结肠螺旋体病-结肠炎(colitis)和细胞内劳森菌引发的猪增生性肠炎-回肠炎(ileitis)。诺华公司研究人员在一有猪痢疾感染的猪场,使用50、75、100和150mg/kg沃尼妙林饲料拌料进行猪痢疾预防试验,以100mg/kg饲料的泰妙菌素拌料为阳性对照组,不加药饲料为阴性对照组,进行猪痢疾预防试验。加药料连续饲喂10d后再饲喂空白料14d,然后宰杀。治疗后的日增重数据和临床记录结果表明,沃尼妙林对猪痢疾的预防效果明显优于泰妙菌素组和空白对照组。Stipkovits等于9日龄分别用不同抗生素进行拌料治疗人工感染猪肺炎支原体的1日龄SPF猪,人工感染败血性巴氏杆菌的8日龄SPF猪,人工感染胸膜肺炎放线杆菌的15日龄SPF猪,连用12d后剖解检查,结果表明,疗效最好的是沃尼妙林+金霉素,其次是泰妙菌素+金霉素、替米考星及林可霉素+金霉素。Morgan等采用25ppm的沃尼妙林对人工感染结肠菌毛样短螺旋体的4～6周龄的猪进行治疗,结果表明,病猪的身体状况得到明显改善,97%的病猪完全治愈,表明沃尼妙林对由结肠菌毛样短螺旋体引发的结肠炎有良好的治疗效果。Jones等在英国一家有回肠炎发病史的猪场采用75ppm的沃尼妙林进行为期14d的预防试验,试验结果表明,给药后的猪与不给药的猪相比,增重率明显升高,腹泻发生率显著下降,81%的给药猪体内已检测不到细胞内劳森菌。Stipkovits等在一高发呼吸道疾病的牛场,用沃尼妙林进行预防试验,结果表明,沃尼妙林能有效预防牛感染支原体,减轻呼吸道症状,促进机体增重。8不适当的药物和副作用8.1与聚醚离子载体类药物的相互作用沃尼妙林可与聚醚离子载体类药物,如莫能菌素、盐霉素、拉沙里菌素、马杜霉素等相互作用,导致不能区分其与聚醚离子载体类药物的中毒症状。因此,在使用沃尼妙林前后至少5d内,不能使用离子载体类药物,否则将导致严重生长抑制、运动失调、麻痹或死亡。8.2发病猪的死亡率采用Econor(沃尼妙林预混剂)对猪进行治疗时,欧盟曾于1999～2000年报道有不良反应发生,主要发生在丹麦和瑞典(芬兰和爱尔兰各一例)。在这些国家,所有猪的发病率在0.03%～1.76%之间,死亡率1%。发病猪主要表现为发热,食欲不振,严重时共济失调,喜卧,浮肿或红斑(主要在臀部),眼睑水肿。对敏感动物的不良反应对照试验研究发现,其死亡率低于1%,但如果再次感染,死亡率会随之增大。一项流行病学研究调查发现,不良反应的发生与丹麦和瑞典的长白猪及其杂交种(尤其幼猪