大鼠椎间盘析出模型脊髓血流量的电针效应

大鼠椎间盘析出模型脊髓血流量的电针效应

椎间盘取出引起的运动机械障碍是人类和动物健康的重要疾病。以电针为主的针灸疗法在医学临床应用广泛,近来随着宠物医疗的发展,在运动机能障碍性疾病,尤其是犬重症椎间盘脱出/突出(intervertebraldiscextrusion/protrusion)也显示出了良好的治疗效果。电针疗法对犬椎间盘病虽然疗效显著,但有关作用机理的研究鲜见报道。犬椎间盘脱出病的实质是脊髓受椎间盘压迫损伤,神经传导功能障碍。目前虽有关于脊髓损伤动物模型的报道,但是这些模型难以准确模拟临床犬重症椎间盘脱出/突出,且有关电针机理的研究以脊髓的形态学及神经细胞损伤与修复相关基因的变化等为主。然而,随着研究的深入,国内外学者越来越关注脊髓损伤与修复过程中微血管所起的重要作用;另外从中国传统兽医学分析,气血不足或气滞血瘀是伴随着犬椎间盘病各个阶段的普遍现象,有待现代微观指标的进一步验证。本实验以大鼠制作椎间盘脱出模型模拟临床急性发病犬,采用激光多普勒血流仪,研究该病脊髓的“气、血”微观指标变化规律,进而观察电针对其的影响,为进一步揭示动物椎间盘脱出/突出的“气、血”异常本质与针灸理气活血的效应和机理积累资料。1材料和方法1.1实验动物房[scxk-军清洁级SD雄性大鼠37只,体重为200~250g,来源于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心【SCXK-(军)2007-004】,饲养于北京农学院实验动物房[SYXK(京)2010-0003]。实验动物随机分为空白对照组、对照组和电针组,每组数量分别为:9、14和14只。对照组和电针组制作椎间盘脱出模型,电针组接受电针治疗,空白对照组只通过手术暴露脊髓,不进行脊髓压迫,也不施以任何治疗。1.2治疗方法与仪器激光散斑血流监测视频系统(PeriCamPSISystem,Perimed,Sweden),仪器相关参数设定:监测激光与大鼠L1段脊髓垂直,探头与L1段脊髓背侧的监测距离设定为15cm,分辨率为0.42mm,监测区域设定面积为3.5mm2的圆,圆心位于L1段脊髓背侧的中心,采样频率:每秒3帧图像;东华牌电针治疗仪(WQ-6F);毫针(苏州天协针灸器械有限公司,规格0.2×25mm);微型摆锯(surgicXT,NSK,Japan);戊巴比妥钠(北京化学试剂公司,德国进口分装);注射用青霉素钾、注射用硫酸链霉素(河北远征药业有限公司);自制硅胶垫片(见图1:一端呈楔形,长4mm、宽2mm、厚1mm,取材于8Fr无菌双腔导尿管,CreateMedicCo.,Ltd.,Japan)。1.3骨髓细胞的分离和模型大鼠的再分离大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/(kg·bw),麻醉后,俯卧保定,以胸腰段椎体为中心备皮、消毒。手术严格无菌操作,以第一腰椎(L1)为中心,在背正中线处切开皮肤,切口长约2cm,常规方法暴露L1的棘突、椎板和左侧关节突,用微型摆锯打磨L1背侧及左侧椎板,再用眼科有齿镊小心去除整个背侧椎板及左侧关节突,充分暴露L1段脊髓背侧;模型大鼠用自制的硅胶片从L1的左侧将之填塞入T13段脊髓的左腹侧位(如图1所示),空白对照组大鼠同样暴露脊髓不进行压迫,血流检测完后分层缝合切口。术后每只大鼠肌内注射青霉素钾3万U/(kg·bw),2次/日,连用3d。同时注射硫酸链霉素15mg/(kg.bw),2次/日,连用3d,单独分笼饲养,饮水和饲料正常供给。1.4病例普遍穴位的治疗将28只椎间盘脱出模型大鼠随机平分为对照组和电针组。参考课题组多年电针治疗犬胸腰段椎间盘脱出病例常用的穴位并考虑动物模型实际情况,选用足三里穴和趾间穴。毫针刺入穴位后,两侧的穴位上下为一组分别接通电针仪进行治疗(强度以大鼠能够忍受为宜)。每日上午治疗1次,每次20min。因临床病例通常在电针治疗2周后即有明显好转,所以,初步将大鼠脊髓压迫模型的治疗时间也定为2周。1.5电针治疗后小鼠骨髓血流量手术暴露对照组和电针组大鼠L1段脊髓后,以多普勒血流仪检测脊髓压迫前背侧血流量10min。硅胶片压迫造模后再次检测大鼠L1段脊髓血流量10min。随后,电针组大鼠进行电针治疗,时间为20min,同步记录脊髓血流量。电针后,继续检测大鼠脊髓血流量10min。电针组每日治疗1次,14d后,麻醉各组大鼠,暴露L1段背侧脊髓,检测脊髓血流量10min。1.6运动高能的判断术后,分别在第1、4、7、14天采用大鼠BBB评分法对各组大鼠后肢运动机能进行评定(各种运动机能正常为满分21分)。其中第1天在大鼠从麻醉状态完全清醒后开始评分。1.7统计分析数据以表示,采用t-检验/LSD多重比较分析对照组与电针组差异显著性,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1大鼠腰椎前术后运动能力比较造模前大鼠后肢BBB评分结果皆为满分21分,造模后第1天左、右后肢评分结果分别为(0.32±0.16)、(5.93±0.97),大鼠后肢均表现瘫痪。由图2可知,与造模前比较,大鼠椎间盘脱出模型两后肢运动机能显著降低(P<0.001),造模成功。其中左后肢降低程度更大,这可能与硅胶片压迫脊髓左侧腹角有关。空白对照组为手术通路对照组,手术后左、右后肢的评分皆为20.78±0.15,由图3可知,手术后大鼠后肢运动机能与手术前比较没有显著性差异,说明手术通路本身对大鼠后肢运动的影响可忽略不计。2.2大发作模型中的骨髓血流量改变由图4可见,压迫前脊髓血流量为(245.27±4.25),压迫后为(161.67±6.49),呈极显著下降(P<0.001)。2.3电针期间不同时间点髓压血流量比较由图5可见,电针组大鼠在脊髓压迫后进行的20min电针刺激过程中脊髓血流量由(164.70±8.58)上升至(198.33±7.49),与电针前和同时间段的对照组(155.41±9.15)比较,差异显著(P<0.05)。电针结束后的10min脊髓血流量逐渐减小至(176.56±8.19),高于同时段对照组(154.27±9.32),差异无显著性。电针连续治疗14d后,脊髓血流量升高至(278.98±12.00),显著高于脊髓压迫后(P<0.01),并高于压迫前水平(见图4)。与压迫后比较,对照组大鼠在14d后脊髓血流量也升高至(233.26±11.24),差异有显著性(P<0.01),但显著低于电针组(P<0.01)。2.4运动时机评分随着时间的延长,对照组和电针组大鼠后肢运动功能都逐渐好转。在第1天对照组和电针组左后肢运动功能评分为(0.36±0.29)、(0.29±0.16),电针组低于对照组,差异无显著性。由图6可知,电针组大鼠在电针治疗第4天开始,左后肢运动机能得分为(2.43±1.06),高于对照组的(1.57±1.07),其中在第7天、第14天评分结果为(4.36±1.38)、(9.86±1.87),与第1天比较,运动机能得分显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)升高。对照组大鼠在第14天后,其左后肢运动机能得分为(4.86±1.60),与第1天比较也显著升高(P<0.01),但仍显著低于第14天电针组大鼠得分(P<0.01)。由图7可知,电针组大鼠在电针治疗第1天开始,右后肢运动机能得分(6.29±1.55),高于对照组(5.57±1.20),差异无显著性。其中在第7天、第14天得分为(13.57±1.26)、(16.07±1.08),与第1天比较,差异有显著性(P<0.05)。对照组大鼠右后肢运动得分也逐渐增加,在第14天其右后肢运动机能得分为(11.79±1.53),显著高于第1天、第4天(P<0.05),但仍显著低于第14天电针组大鼠得分(P<0.05)。3激光散斑血流监测是治疗特殊患者的手术方法椎间盘脱出在兽医临床是引起犬瘫痪的常见病,其本质是脱出的髓核及其炎性反应物质压迫脊髓或神经根引起的损伤,影响上行/下行运动神经纤维信号传导,进而导致运动机能障碍。近年来,脊髓损伤恢复一直是国内外学者研究的热点,利用动物模型来研究脊髓损伤的机理报道较多,主要有脊髓打击法、钳夹法、切割法、动脉阻塞法及光化学诱导法等。而脊髓损伤后微血管的损伤又是脊髓二次损伤的关键环节。因此,众多学者越来越关注脊髓生理/病理状态下微血管相关功能的变化,其中,脊髓血流动力学指标的检测是一个重要技术。目前,脊髓血流动力学指标的检测方法主要有:氢清除法、微球法、闭合性脊髓窗技术和激光多普勒法。其中,氢清除法需要将微电极插入到脊髓内部,对脊髓有一定的损伤,且检测的范围较局限。微球法需要将放射性核素或荧光素标记的微球通过心脏注入循环系统,还需将检测的脊髓节段取出,分光光度计测定脊髓中微球的含量,而且放射性核素污染环境,各种微球都有造成血栓的可能性。闭合性脊髓窗技术可以观察到血管直径的变化、白细胞黏附和红细胞流速,但是这种技术操作复杂,对仪器要求高,推广使用有一定难度。激光多普勒法无需造影剂,也无需扫描,能以较高的空间分辨率和时间分辨率非侵入、很好地实时动态检测脊髓血流。由此可见,激光多普勒法是较为适宜的检测脊髓血流的方法,且能实时或长期检测电针对脊髓血流的影响。使用该技术的众多研究结果表明,上述脊髓损伤模型伴随的显著的微循环血流灌注障碍是脊髓损伤的重要机制。在椎间盘脱出状态下脊髓血流的变化鲜有研究,针灸对其的影响也未见报道。本实验采用的激光散斑血流监测视频系统是激光多普勒微循环血流灌注检测的最新技术,该系统能够非接触、无伤害实时动态监测大鼠脊髓血流,具有较高的分辨率,能在同一感兴趣区域提供实时曲线和视频记录,是目前定量观测脊髓微循环血流的最佳选择。犬重症椎间盘脱出时髓核进入椎管后其对脊髓的压迫持续存在,打击等短时间的损伤不能反映实际情况。为此,课题组模拟临床犬实际,采用自制硅胶垫片在大鼠T13椎腔填充压迫脊髓腹侧角部,采用大鼠BBB评分法对大鼠后肢运动功能进行评定,试验结果表明模型组大鼠后肢均出现严重运动机能障碍,建立了椎间盘脱出瘫痪模型。多普勒血流仪检测结果表明压迫后脊髓血流量极显著降低(见图4),以上结果提示我们建立的大鼠椎间盘脱出模型已达到临床犬椎间盘脱出病例具有的肢体萎弱、气血壅滞的症状。另外,造模后大鼠两后肢运动机能障碍程度不一,左后肢较右后肢严重,原因可能与仅压迫脊髓一侧腹角有关。传统医学认为:“凡病,皆由气血壅滞,不得宣通,针以开道之,灸以温暖之”,指出经脉气血的异常是疾病发生发展的主要因素,而针灸主要通过“通经活络,活血化瘀,调节气血”发挥治疗效应。椎间盘病对中国传统兽医学来讲是一个相对较新的领域,按照传统医学理论分析,其属于“腰腿痛”、“痹证”和“痿证”的范畴。《黄帝内经》论痿,提出治痿独取阳明。对自制大鼠椎间盘脱出模型,我们选用了治疗犬椎间盘脱出病例常用的后肢阳明胃经的后三里穴和趾间穴,结果表明无论是造模后即刻电针还是电针治疗两周后,脊髓血流量均显著提高,与吴永刚等研究结果一致。Tsuchiya等研究表明针刺手掌和前臂可以显著促进同侧腋静脉NO的产生,同侧手掌的皮下血流也有显著升高。因NO具有扩张血管的作用,因此,电针后三里穴和趾间穴提高大鼠椎间盘脱出模型脊髓血流量可能与脊髓局部血管组织产生NO有关,需进一步研究。针灸的基本原理是通过调动和调节机体固有机能而实现防病治病作用。在椎间盘病导致的脊髓损伤的恢复过程中应该也不例外。本实验大鼠在模型制作后均造成重度瘫痪,随着时间的延长,对照组有明显的恢复表现,但在14d疗程结束时,结果显示电针能显著促进瘫痪大鼠后肢运动能力的提高。针对犬胸腰段椎间盘病,课题组经多年临床实践确定了以肾俞、膀胱俞和后三里与趾间穴组为主的电针治疗方案,临床效果理想。对椎间盘脱出IV级瘫痪(完全瘫痪,有深部痛觉)病例在2周内恢复行走的有效率达到93%以上,远远领先于西医保守疗法,并超过手术疗法。对V级瘫痪(完全瘫痪,无深部痛觉)病例(发病超过48h,西医放弃治疗者)的有效率也达到71%,说明针灸疗法对严重脊髓损伤的V级瘫痪病例也有较高的治疗价值。本试验电针对大鼠椎间盘脱出模型的治疗效果与临床疗效基本一致。椎间