土壤中总dna提取与纯化研究

土壤中总dna提取与纯化研究

从自然环境中提取细菌dna是一种非常有用的方法。它可以用来检测不可培养的细菌，并跟踪一些目标菌株和重组基因的自然环境行为。也可以用来揭示土壤微生物生态系统中的基因的多样性及其随环境的变化。从环境样品中抽提和纯化DNA是最关键的技术问题之一。来自环境中的样品含有非常复杂的成分,尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中不能去除掉,直接影响后续的PCR扩增、杂交、内切酶消化等。本文建立了适合从不同土壤提取总DNA并进行纯化的方法,可应用于环境中微生物的研究。1材料和方法1.1土壤样品的采集和性质试验从各地采集了不同性质的土壤,基本性质如表1。1.2枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌大肠杆菌E.coliDH5α,霉状芽孢杆菌(Bacillusmycoides),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)都是本实验室保存;邻单胞菌(Plesiomonassp.)M6为本实验室分离的甲基对硫磷农药降解菌(带有甲基对硫磷水解酶基因mpd)。1.3土壤中氮提取方法1.3.1sds-k的提取称取5g土壤样品,与13.5mLDNA提取液(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,100mmol/L磷酸钠,1.5mol/LNaCl,1%CTAB,pH8.0)混合,再加入100μL蛋白酶K(10mg/mL),于225r/min摇床上37℃摇动30min,接着加入1.5mL20%SDS,65℃水浴2h,每隔15～20min轻轻颠倒几下,室温6000×g离心10min,收集上清,转移到50mL离心管中,土壤沉淀再加入4.5mL提取液和0.5mL20%的SDS,涡旋10s,65℃水浴10min,室温6000×g离心10min,收集上清合并于上次上清。重复上述操作,收集上清与前两次上清合并。上清与等体积的氯仿-异戊醇(24:1体积比)混合,离心,吸取水相转移至另一50mL离心管中,以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀1h,室温16000×g离心20min,收集核酸沉淀,用冷的70%乙醇洗涤沉淀,重悬于灭菌的无离子水中,最终体积为500μL。1.3.2土壤中dna的提取霉状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌过夜培养,离心收集菌体,无菌水洗涤,再悬浮于等体积无菌水中。各吸取1mL上述3种悬浮液,分别加入5g灭菌土壤Y1中,摇床振荡吸附30min后提取DNA。在此提取方法的基础上,水浴结束后,于-70℃冷冻,然后于65℃融化,反复3次,比较两种提取方法的效果。1.3.3提取dns的定量以λDNA(0.569μg/μL)作为标准,与提取DNA同时电泳后,经溴化乙锭染色后,用TANON凝胶分析软件进行分析定量。1.4土壤中的dna纯度1.4.1纯度方法透析袋电洗脱纯化回收法,具体操作参见文献1.4.2纯化回收效率吸取20uL的标准λDNA(0.0569μg/μL),按上述回收方法回收DNA,回收DNA与标准λDNA同时电泳后用TANON软件进行定量,计算纯化回收效率。1.5土壤中残留生产力和质量分析1.5.1土壤细菌dna提取9个土样都于121℃湿热灭菌1h,提取灭菌土壤的DNA检查灭菌情况。E.coliDH5α隔夜培养后,离心收集菌体,无菌水洗涤3次,然后悬浮于等体积无菌水中,以无菌操作取1mL分别接种5g的9种灭菌土壤,摇床振荡吸附0.5h后提取。同时设置纯菌作为对照。所有处理与对照均有3个重复。提取后定量对照与各处理的DNA提取量,计算提取效率。提取效率=各处理的提取量/对照的提取量×100%。1.5.2pcr扩增体系及扩增条件从土壤DNA扩增16SrDNA的引物1序列为:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(E.colibases8to27),引物2序列为:5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(E.colibases1507to1492)。PCR扩增反应体系:10×缓冲液5μL,dNTP(25mmol/L)4μL,引物1(25pmol/μL)2μL,引物2(25pmol/μL)2μL,Mg2+(25mmol/L)4μL,模板(土壤DNA)10μL,TaqDNA聚合酶2.5U,ddH2O22.5μL,总体积50μL。反应参数:95℃变性10min;95℃2min,42℃30s,72℃4min,35个循环;72℃延伸20min。1.6土壤中目标菌株dna提取灵敏度1.6.1土壤dna的提取菌株M6(带有mpd基因)是甲基对硫磷降解菌,其甲基对硫磷水解酶基因已被克隆。菌株M6活化后,隔夜培养,离心收集菌体,无菌水洗涤3次,以10-2-10-8系列稀释,各稀释度分别取1mL加入到5g土壤Y1中,摇床振摇30min,然后提取DNA进行纯化。提取前用含有甲基对硫磷的肉汤平板计数添加到土壤中的M6菌。1.6.2pc-pcr反应体系及参数引物1为:5′-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3′,引物2为:5′-GAATTCTCGAGCTTGGGGTTGACGACCG-3′。扩增反应体系:10×缓冲液2.5μL,dNTP(25mmol/L)2μL,引物1(25pmol/μL)0.5μL,引物2(25pmol/μL)0.5μL,Mg2+(25mmol/L)1.5μL,模板(土壤DNA)3μL,TaqDNA聚合酶2.5U,ddH2O14.5μL总体积25μL。反应参数:95℃变性2min;95℃1min,45℃1min,72℃2min,35个循环;72℃延伸7min。2结果和分析2.1土壤理化性质与土壤细菌数、总dna提取量的关系用SDS高盐抽提法从9种不同土壤中都提取出了DNA,而灭菌后的土壤,由于在高温灭菌过程中核酸被分解,都不能提取到(图1)。并且用该方法提出的总DNA,其片段均大于23.1kb,有利于对其进行后续操作。每g干土中提取的DNA从3.30μg-13.41μg,提取量最大的是土壤Y1,最低的是土壤Y9。土壤中总DNA的提取量与土壤的有机质含量呈正相关(r=0.91)。在同一种土壤中,例如红壤,由于耕作措施的不同,使土壤有机质含量也变化很大,土壤Y9由于不用有机肥料,土壤有机质含量非常低,仅为0.99%,而增施秸杆和有机肥的土壤土壤有机质明显升高,土壤中可培养的细菌数和总DNA提取量均相应地发生变化(表2)。由此也说明,SDS高盐抽提法适合于从不同的土壤中抽提DNA。2.2种芽孢杆菌添加物理性的处理方法对dna的提取效果由于基于SDS的的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌效果不好,本文增加物理性的处理方法,由图2可以看出,经过冻融处理后,3种芽孢杆菌均提取到了DNA,未经冻融处理的霉状芽孢杆菌未提取到DNA,并且冻融处理也未对DNA造成大的剪切,提取的DNA片段还大于23.1kb。2.3不同类型土壤中样品的提取效率各种土壤由于性质不同,特别是土壤中粘粒的比例不同,土壤总DNA的提取效率也会有很大的差异,9种土壤总DNA的提取效率从93.45%～60.51%,最高的为Y4,提取效率达到93.45%,最小的为Y6,提取效率为60.51%,(表3)土壤Y4为黄沙壤,粘粒所占比例最小。从表3中还可以看出,同一类型的土壤,提取效率差别不大。土壤中的粘粒由于会造成微生物紧紧吸附于其上而无法分离,或由于其周围的空间小而造成无法与菌体裂解液发生作用。所以DNA提取效率与土壤中粘粒的比例是呈负相关的。2.4干预d的纯度2.4.1纯化回收效率20μL的标准λDNA(0.0569μg/μL)经透析袋回收后,得到0.7436±0.0702μgDNA,则纯化回收效率为:0.7436/(20×0.0569)×100%=65.34%。透析袋回收法虽然操作复杂,但对于大片段DNA却非常有效。2.4.2纯化除杂剂由于从土壤中提取的DNA含有腐质酸类物质在提取过程中无法去除掉,若不经过纯化,则由于所含的腐质酸等杂质的干扰,使其不能用于下一步的操作,如PCR扩增、杂交等。本文从纯化后的土壤DNA中通过PCR直接扩增出土壤细菌的16SrDNA(图3),证明经过该方法纯化后的土壤DNA,适合进行后续的操作。2.5pcr扩增目的条带使用一对特异引物扩增M6菌株的mpd基因片段,大小为1.0kb左右。取3μL纯化后的DNA做模板,可以从每g添加362个菌体的Y1土样中扩增出目的条带(图4)。而不添加M6菌株的土样则不能扩增出目的条带。说明所建立的提取与纯化方法对提取土壤中的目标菌株是非常灵敏的。应用该方法来分离土壤中含量少的微生物或基因资源,或者用来监测自然环境中的特定菌株或重组基因也是行之有效的。3土壤中dna的提取由于土壤本身及其中微生物的复杂性,常规分析微生物的方法如平板计数、生物量测定等方法的准确性受到了极大的限制。从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是一种可行的方法,并已在国外受到广泛的关注。从DNA的角度分析土壤微生物关键是DNA的提取。从土壤或沉积物中提取DNA的方法可以分为两类,一是在土壤中直接裂解微生物体,再提取DNA。另一类是先将微生物菌体与土壤颗粒分开,再提取DNA。一般第一类方法提取效率比较高。从土壤中提取DNA有两个关键步骤:①土壤中菌体细胞的裂解和粗DNA的提取;②粗DNA的纯化。粗DNA的提取和纯化均有不同的方法,有些工作者应用物理方法破碎菌体,如超声波破碎等,所得到的片段较小。也有用微型柱进行粗提DNA的纯化,但每次能纯化的样品少,对于大片段的DNA回收率低。选用哪种方法的组合,要根据实验的要求选择。本实验选择基于SDS的高盐提取法和透析袋回收法,既保证了一定的提取与回收效率,又兼顾了DNA的质量,使在提取和纯化过程中,DNA不会受到机械损伤。提取方法的效率及其灵敏度对于后续研究是十分重要的,高效提取才能具有代表性。基于SDS的高盐提取法对9种土壤总DNA的提取效率从93.45%～60.51%,