饲用纤维素酶检测方法的比较

饲用纤维素酶检测方法的比较

纤维素酶在饲料工业中得到了广泛应用，其质量检测变得越来越重要。纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为Cx酶。据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于CX酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。1cmc羧甲基纤维法1.1材料表面1.1.1饲料中的纤维素酶由河南省科学院生物研究所提供。1.1.2试剂磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。1.1.3仪器721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。1.1.4试剂的制备1.1.4.酸度测定方法制取0.2mol/L磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。1.1.4.u3000酸液制备准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。1.1.4.酒石酸钾钠溶液配制准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。1.1.4.40.1%标准葡萄糖溶液准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。1.2,5-二苯基水杨酸溶液分别吸取0.1%标准葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,分别定容至50mL。再分别吸取上述溶液各2.5mL于试管中,各加2.5mL3,5-二硝基水杨酸,煮沸5min(另作1管对照,取2.5mL蒸馏水,加2.5mL3,5-二硝基水杨酸,同样煮沸5min)。冷却后,用721型分光光度计在530nm波长下比色,记录各管的光密度值,以光密度作纵座标,对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横座标,绘制标准曲线。1.3,5-二苯基水杨酸5-甲基苯基糖还原糖的制备通过“四分法”精确称取酶样品2.00g,加温水90mL、柠檬酸缓冲液10mL,40℃浸提1h,以脱脂棉过滤备用。根据酶活高低,上述酶液需适当稀释使其产生的还原糖在100～500μg之间,光密度在0.1～0.6。取1支小试管(15mm×150mm),加羧甲基纤维素钠溶液2.0mL,于50℃水浴中预热2～3min,加稀释酶液0.5mL,保温30min,取出加入3,5-二硝基水杨酸2.5mL,沸水浴煮沸5min,冷却后用分光光度计530nm处比色测定OD值。另取小试管加羧甲基纤维素钠2.0mL,先加入2.5mL3,5-二硝基水杨酸,再加酶液0.5mL,其他操作同样品测定作空白测定。1.4净葡萄糖发展CMC酶活力=B×n0.5mg/g⋅30′⋅50℃=B×n0.5mg/g⋅30′⋅50℃式中:B—从标准曲线中查得的净葡萄糖毫克数(mg);n—酶液稀释倍数;0.5—测定时吸取稀释酶液毫升数(mL)。2过滤纸法2.1材料表面2.1.1滤纸的制备醋酸钠(AR)、冰醋酸(AR)、甲苯(AR)、氢氧化钠(AR)、酒石酸钾钠(AR)、苯酚(AR)、亚硫酸钠(AR)、3,5-二硝基水杨酸(AR)、新华5号滤纸(剪成1cm×3cm纸条)。2.1.2仪器同CMC法。2.1.3试剂的制备2.1.3.10.1ol/mlh4.6乙酸-醋酸钠缓冲液准确称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)6.70g和冰醋酸2.60mL,以蒸馏水溶解,定容至1000mL。2.1.3.23、5-二硝酸显色液配制同CMC法。2.2标准曲线的绘制同CMC法。2.3-二苯基水杨酸解甲基应环氧化法酶液制备同CMC法。样品测定方法为:准确吸取4mL酶液和1mL缓冲液于试管中,加入新华5号滤纸条一条,滴入甲苯2～3滴防腐,40℃静止反应24h。吸取滤纸酶解液1mL,加蒸馏水1.5mL、3,5-二硝基水杨酸溶液2.5mL于试管中,沸水浴煮沸5min,冷却后在530nm处比色测定光密度OD值。吸取4mL蒸馏水代替4mL酶液,其他操作同样品测定作空白测定。2.4酶活剂滤纸酶活力(FB)=B×n45×1mg/g⋅24h⋅40℃(FB)=B×n45×1mg/g⋅24h⋅40℃式中:B——从标准曲线上查得的净葡萄糖毫克数(mg);n——酶液稀释倍数;45——545——5mL反应液中含4mL酶液;1——吸取1mL酶解液进行测定。3底动产地的酶活力测定作为底物的羧甲基纤维素钠,用不同厂家