hogg1基因多态性和血8-羟基脱氧鸟嘌呤水平与急性心肌梗死的相关性研究

hogg1基因多态性和血8-羟基脱氧鸟嘌呤水平与急性心肌梗死的相关性研究

在二甲基氧化损伤中，脱氧核糖（8-hydrolydeoxygnatico，8-hydg）是最具代表性的损伤产物。它是评价氧气和d氧化损伤的一般生物指标。人类8-羟基鸟嘌呤糖苷酶(human8-hydroxyguanineglycosylase,hOGG1)是一种DNA修复酶,可以对损伤了的DNA进行修复,是8-OHdG特异的切除修复酶。研究表明hOGG1基因第7外显子第1245位碱基的C/G多态,使326位密码子或编码丝氨酸(Ser)或编码半胱氨酸(Cys),表现出不同的酶活性,可能与个体的氧化损伤相关。笔者研究hOGG1基因Ser326Cys多态性和血清8-OHdG水平与急性心肌梗死(AMI)的关系,从而探讨AMI的遗传易感性和氧化应激机制在AMI发病中的作用。1数据和方法1.1病例选择选择标准运用病例-对照的研究方法,连续入选2009年1月至2011年6月间在本院住院的祖籍为新乡地区的患者。其中确诊为AMI者300例(男158例,女142例)作为病例组。入选标准:均符合2002年AHA/ACC关于AMI的诊断标准:①持续胸痛20min以上;②常规12导联心电图至少相邻两个导联ST段抬高(胸导联≥0.2mV、肢体导联≥0.1mV),或无导联ST抬高但至少有相邻两个导联发生持续ST段压低≥0.1mV,或有对称性T波倒置及心电图有动态改变;③血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平升高超过正常值水平上限2倍以上或肌钙蛋白T(cTnT)>0.1ng/ml。排除:①年龄小于30岁,大于75岁;②合并心脏瓣膜病、心肌病和严重心力衰竭[左室射血分数(LVEF)<0.35];③近期接受过抗氧化治疗者;④糖尿病合并视网膜病变及神经病变者;⑤精神心理性疾病患者;⑥肿瘤、急慢性炎症、肝肾疾病、自身免疫性疾病者;⑦近期有大创伤或者经历大手术者。对照按1:1配对原则,选择居住于当地、同性别、年龄相差5岁以内的同期住院的冠心病疑似人群,共300例作为对照组。入选标准:冠状动脉造影证实冠状动脉未见病变者。排除标准同上。本研究经本院医学伦理委员会批准,并征得所有入选对象知情同意,所有研究对象均无亲缘关系,均填写知情同意书。1.2生化指标检测记录所有入选对象的一般资料包括年龄、性别、体重,测量血压(休息状态下,非同日上午三次测量血压,取其平均值),计算体重指数,询问有无高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、高血脂等。所入选者取血前24h禁酒及高脂饮食,空腹12h后取肘静脉非抗凝血6ml,抽血后lh内以3000rpm离心20min,分离血清,一部分直接用全自动生化分析仪(日立公司,日本)测定生化指标包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FBG),一部分置于-20°C冰箱中待测8-OHdG。人血清8-OHdG测定采用ELISA法,按试剂盒(购自美国Trevigen公司)说明书操作。1.3pcr检测细胞中人体内细胞的表达应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测hOGG1基因多态性。抽取入选者外周静脉血2ml置入EDTA抗凝管,用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天维时代科技有限公司)提取白细胞DNA,置于-20℃冰箱保存。引物为5′-GGAAGGTGCTTGGGGAAT-3′和5′-ACTGTCACTAGTCTCACCAG-3′。反应在MJPTC-220PCR仪(M.J.Research公司)进行。PCR反应体系为25μl,按下述程序进行扩增:94℃预变性3min,然后进行35个循环(94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸1min),最后72℃延伸5min。所有的PCR产物用Fnu4HI内切酶(Fermentas公司)37℃消化12h,3%琼脂糖凝胶(含0.5mg/L溴化乙啶)电泳1h后,用紫外分析仪观察结果。1.4比较方法及样本采用SPSS10.0统计软件,定量资料以x¯±sx¯±s表示,定性资料用百分比表示。组间频率比较用χ2检验,组间连续变量比较采用单因素方差分析或独立样本t检验。应用多因素Logistic回归分析来控制各混杂因素的影响,判读基因型后,计算各组基因型频率及等位基因频率,以Hardy-Weinberg平衡检验,确认基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡,计算OR及95%CI以进行危险度评价,分析比较病例组hOGG1各基因型8-OHdG、血脂和血糖水平,以P<0.05为差异有显著性。2结果2.1cd水平和糖尿病和吸烟例数与对照组比较,病例组8-OHdG、FBG和LDL-C水平及糖尿病和吸烟例数明显增高(P均<0.05)。性别、年龄、血压、体重指数、TC、TG、HDL-C及饮酒例数两组无差异(P均>0.05)(表1)。2.2bp片段基因型hOGG1基因扩增目的片段大小为200bp。经酶切后有3种基因型:仅有200bp片段为Ser/Ser基因型,即野生型纯合子,既有200bp片段,又有100bp片段为Ser/Cys基因型,即杂合子;仅有100bp片段为Cys/Cys基因型,即变异型纯合子,相应地产生3种不同的电泳条带(图1)。2.3cys基因型的危险因素分析两种等位基因频率分布无差异(P=0.16),三种基因型频率分布差异有显著性(P=0.001),病例组Cys/Cys基因型频率明显高于对照组,Ser/Cys基因型频率明显低于对照组,二者比较差异有显著性(P=0.001)。进行Logistic回归分析,结果显示:①相对于Ser/Cys基因型,携带Cys/Cys和Ser/Ser基因型者发生AMI的危险性均增加(OR1=2.12,95%CI:1.38～3.25和OR=1.55,95%CI:1.08～2.24),经校正8-OHdG、FBG、LDL-C水平和糖尿病、吸烟例数等混杂因素后,提示:Cys/Cys基因型是发生AMI的危险因素(OR2=1.97,95%CI:1.17～2.48),Ser/Ser基因型的作用不明显(OR2=1.35,95%CI:1.01～2.00),可推测Ser/Cys基因型可能是一种保护性因素。②因Ser/Ser基因型的作用不明显,笔者将Ser/Ser和Ser/Cys基因型合并计算,发现携带Cys/Cys基因型者患心肌梗死的风险增加(OR1=1.75,95%CI:1.18～2.59),经校正后,提示Cys/Cys基因型可能是AMI的危险因素(OR2=1.99,95%CI:1.20～2.69)(表2)。2.4cys基因型的检测病例组hOGG1各基因型比较,Cys/Cys基因型的8-OHdG、FBG和LDL-C水平明显高于Ser/Ser+Ser/Cys基因型(P<0.05)(表3)。3cys基因型与ami相关性研究最近的研究发现hOGGl低表达细胞其DNA修复能力降低。对于hOGGl基因,目前主要研究第7外显子的Ser326Cys多态性与肿瘤易感性的关系,且多数学者认为hOGGl的表达与其多态性相关,hOGGlCys326的修复能力低于hOGGlSer326,携带Cys/Cys基因型的人群患肿瘤的风险比较高,并且可能与其他环境因素及生活习惯联合作用影响癌症的发病。笔者的研究发现,AMI患者Cys/Cys基因型频率明显高于正常对照组,Ser/Cys基因型频率明显低于对照组,两种基因型比较差异有显著性(P=0.001),相对于Ser/Cys基因型,携带Cys/Cys和Ser/Ser基因型者发生AMI的危险性均增加,经校正混杂因素后,发现Cys/Cys基因型是发生AMI的危险因素,而Ser/Ser基因型的作用不明显,可推测Ser/Cys基因型可能是一种保护性因素。根据上述研究观点可以推测,携带Cys/Cys基因型者,其DNA修复能力降低,而携带Ser/Cys基因型者,其DNA修复能力可能提高,说明Cys/Cys基因型可能是AMI的危险因素,而Ser/Cys可能是一致保护性基因型。体外实验发现,Cys等位基因的修复能力比Ser等位基因低约7倍。笔者将Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型合并计算,发现携带Cys/Cys基因型者患AMI的风险增加约2倍。表明携带Ser等位基因者,修复能力较高,从心血管领域证明了该基因多态性的作用,这与上述体外实验观点基本一致,说明了hOGGlSer326Cys多态性与AMI之间可能存在相关性。hOGGlSer326Cys多态性与AMI之间是否真正存在相关性,是否通过影响其他临床指标的表达而影响AMI的发病等,文献报道较少。为了进一步探讨hOGG1基因Ser326Cys多态性与AMI相关性,笔者还检测了两组的一般情况和相关临床资料,结果发现AMI组的8-OHdG、FBG和LDL-C水平和吸烟及糖尿病例数明显高于对照组(P<0.05),同时发现病例组hOGG1基因Cys/Cys基因型者8-OHdG、FBG和LDL-C水平进一步增高。Botto等对DNA损伤进行评估,发现与对照组相比,冠心病患者包括8-OHdG在内的碱基损伤以及DNA链断裂的水平明显升高,8-OHdG升高的水平与冠状动脉病变支数及冠状动脉狭窄程度成正相关,并且DNA损伤与糖尿病及高血脂等冠心病的危险因素也有关系。笔者的研究与上述结论部分一致。表明AMI与吸烟密切相关,并与hOGG1基因型、8-OHdG、LDL、及FBG可能存在一定的关系。目前的研究表明,高血糖状态加剧氧化应激时DNA的损伤,脂质代谢紊乱是造成动脉粥样硬化的主要因素,血糖增高患者常伴发脂质代谢紊乱,从而诱导活性氧产生增多,导致氧化应激的发生,可能导致内皮功能紊乱和心血管并发症,而hOGG1基因多态性与修复DNA的活性相关。综合上述观点,笔者推断,hOGGl基因多态性可能影响hOGGl表达,携带Cys/Cys基因型的个体hOGGl表达下降,使其识别和切除DNA双链中的8-OHdG能力降低,即修复DNA氧化损伤的能力下降,体内8-OHdG水平增加,使细胞内遗传物质的突变率增高,丧失原有的细胞功能,诱