大鼠慢性后路缺血模型的制备及评价

大鼠慢性后路缺血模型的制备及评价

动脉粥样硬化和其他原因引起的慢性动脉缺血性病变是罕见的，治疗困难。这是血管外科的热点。各种治疗手段都需经动物模型进行观察和验证,目前采用的动物模型是在切除或者结扎动物后肢动脉的基础上造成急性缺血的过程,其病理变化和患肢的代偿机理显然同临床慢性下肢缺血有明显差别,故建立一种肢体慢性缺血状态的动物模型有着重要的应用价值。1材料和方法1.1periflux激光多普勒血流检测仪器21只SPF级雄性Lewis大鼠,鼠龄4周,体重200~350g,平均245g,首都医科大学宣武医院动物实验中心提供。Periflux激光多普勒血流探测仪,首都医科大学宣武医院血管外科研究所;PeriScanPIM3激光多普勒血流灌注成像仪,瑞典百灵威医疗仪器中国公司;Lecia显微图像分析系统,德国徕卡仪器有限公司;大鼠α-actin免疫组织化学试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;手术显微镜,首都医科大学宣武医院再生医学实验室提供。1.2大鼠左髂动脉切除20只Lewis大鼠采用随机数字表的方法随机分为急性缺血组(n=10)和慢性缺血组(n=10),另1只大鼠行左髂动脉切除+左股动脉切除术。1.3模型生产1.3.1股动脉并结晶股用10%水合氯醛溶液3μl/kg腹腔注射麻醉(后同),仰卧固定,左后肢常规备皮消毒,纵行切开左后肢正中皮肤,于腹股沟下分离出股动脉,范围从腹股沟韧带直至膝关节。结扎股动脉及其于股部的所有分支。将股动脉于腹股沟韧带下切断,双重结扎近端,随后向远端锐性剥离至膝关节,结扎腘动脉及腓动脉,术毕,缝合切口。1.4观察指标1.4.1血指数评估每只动物分别于术后第1、7、14、21、28及48天参照文献的方法行临床缺血指数(clinicalischemiaindex)评估:0分为正常,1分为患肢苍白,2分为肢体血压下降,3分为肢体坏死或跛行。于术后第7天应用PeriScanPIM3激光多普勒血流灌注成像仪检测肢体血流灌注情况。1.4.3腹主动脉形成分析分别于术后第7、14、28、42及49天,以上2组2只大鼠行后肢血流量测定之后,经腹腔水合氯醛溶液注射麻醉,开腹分离腹主动脉后进行穿刺并留管,经留置管注射肝素生理盐水后,以2.5ml/s的速率注射造影剂(泛影葡胺)共5ml,同时对双后肢连续拍照,用数字减影的方法处理造影结果。结果分析:以腹主动脉分叉处显影后1.5s时的照片为依据,计算通过右股骨中点垂直线的血管数目,表示侧支血管开放的程度。由两位独立的观察者对垂直通过股骨中点的侧支血管进行计数。1.4.4双术后股动脉、石蜡包埋及染色每组大鼠在术后第7、14、28、42及49天进行后肢DSA后,采用加大麻醉剂量的方法处死大鼠。取大鼠双后肢股四头肌、腓肠肌中段及线栓处之股动脉,采用甲醛固定、石蜡包埋,用苏木精及伊红(HE)染色。另外对术后第7天(n=2)所取的组织行α-actin免疫组织化学染色,光镜下2组各取3个视野,辅以Lecia显微图像分析系统观察单位视野内棕色颗粒数即阳性细胞数,以单位视野内阳性细胞数/肌纤维数表示小动脉密度。2结果2.1术后平均心肌缺血指数评分急性缺血组术后表现为:后肢跛行2只,紫绀2只,苍白3只,肌肉萎缩1只,未发现后肢坏死,另外2只正常;在术后14d内平均缺血指数评分为2分,在48d为1分。另1只行左侧髂动脉切除+左股动脉切除术的大鼠,术后第1天即出现患侧后肢的缺血坏死,3d后死亡。慢性缺血组术后表现为:后肢跛行1只,紫绀1只,苍白1只,肌肉萎缩2只,另外5只正常,没有出现后肢缺血的临床表现。2.2急性使用与慢性心肌病患者的血流灌注成像仪检查术后第7天,采用随机数字表法分别于急性缺血组和慢性缺血组随机抽取1只大鼠进行激光多普勒血流灌注成像仪检查,见急性缺血组患侧肢体血流明显减少,而慢性缺血组患侧肢体仍有血流灌注(图1)。2.3术后基本恢复急性缺血组患侧后肢血流灌注量在术后第7天出现下降,在术后第28天达到最低点,为健侧后肢的40%;在术后第49天基本恢复正常(ABI=1),见图2A。慢性缺血组患侧后肢血流量下降速度慢于急性缺血组,并出现一段时间的平台期;后肢血流灌注量在术后第14天出现最低点,为健侧后肢的50%,随后患侧后肢的血流量逐渐恢复,但在术后第49天其血流量只恢复到健侧的70%,见图2B。2.42sda组动物模型的结果2.4.1两组不同部位患侧侧支血管数量变化DSA结果显示,患侧远端无主干血管显影,患肢在术后第14天,股部即出现侧支循环开放(图3A),表现为患侧侧支小血管数量多于健侧;在术后第42天达到高峰,患侧侧支血管数量明显多于健侧;在术后第49天两侧侧支血管数量基本相同。行左侧髂动脉+股动脉切除术动物的DSA结果显示:患肢无血管显影,亦未见侧支循环建立(图3B)。2.4.2管基本信息DSA结果显示,在术后第7天,所栓塞的血管基本显影,但是存在部分的充盈缺损(图3C);在术后第14天,仍有部分血管显影,但造影剂颜色变淡,远端显影不佳(图3D)。2.4.3两侧肢体侧支血管计数比较结果见图3E及3F。由图3E及3F可见,急性缺血组术后第7天(早期)至术后第28天患侧肢体侧支血管计数均高于健侧,术后第42天及49天(晚期)两侧肢体侧支血管计数的差异不大。慢性缺血组术后第7天(早期)及第14天患侧肢体侧支血管计数均低于健侧,术后第28天至第49天(晚期)患侧肢体侧支血管计数高于健侧,但两侧肢体侧支血管计数的差异不大。2.52动物组织研究2.5.1术后肌肉结构的破坏①急性缺血组:大部分(n=8)肌肉组织未发现明显的坏死表现;1只术后第7天缺血肌肉组织出现点状坏死,表现为细胞浆均匀一致(图4A);1只术后第28天出现肌肉结构的破坏,其间有大量炎性细胞浸润(图4B);术后第42天患侧后肢肌肉出现萎缩,表现为肌间隙明显增加(图4C)。②慢性缺血组:术后第28天,缺血部位肌肉组织结构完好,未发现肌肉坏死,但有部分大鼠(n=7)后肢肌肉尤其是腓肠肌内可见明显的炎性细胞浸润(图5A);术后第42天,部分(n=2)肌肉组织出现慢性萎缩性改变,表现为肌束间隙增加,但未发现明显的纤维化改变(图5B)。2.5.2血管内皮病变术后第7天线栓处血管的组织学结构保持完好;术后第14天即出现了血管内膜增生,但未见血栓形成;术后第42天由于血管内膜的大量增生,导致血管几乎完全闭塞(图6)。2.5.3小动脉密度肌肉组织中α-actin免疫组织化学染色结果显示:阳性染色定位于小动脉平滑肌细胞的胞浆内,小动脉染色为深棕色,呈管状结构,分布于肌间隙(图7和图8)。急性缺血组术后第7天(早期)股四头肌肌肉组织中α-actin阳性细胞数与肌纤维的比值即小动脉密度患侧高于健侧;慢性缺血组术后第7天患侧股四头肌肌肉组织中小动脉密度与健侧比较差异不大,但低于急性缺血组;慢性缺血组患侧肢体腓肠肌内小动脉密度却高于股四头肌。见表1。3慢性下肢活检动物模型有人统计,在美国,因为严重的肢体缺血而不能行手术或者介入治疗的患者大概有150000人;而我国目前没有详细的统计结果。若肢体缺血不断进展,截肢往往是最后的选择。但是学者也在努力研究通过增加血管的新生(angiogenesis)或者是促进侧支血管的开放或者建立(arteriogenesis)的方法来挽救肢体,并改善症状。最近有很多实验在动物模型的基础上取得了可喜的结果,但是随机对照临床试验却很难取得令人振奋的结果。其中一个重要的原因就是,以上实验采用的是急性后肢缺血动物模型,该模型很难真正反映出实际临床面临的慢性动脉硬化闭塞症的缺血状态。目前,普遍采用结扎或切除大鼠后肢股动脉或髂动脉的方法来制备后肢缺血模型,该缺血模型是后肢急性缺血过程,缺点为缺血维持时间较短,而且多伴有后肢组织的坏死和溃疡,动物容易死亡;更重要的是,其缺血过程与临床上大量慢性下肢缺血过程完全不同。近年来,国内外学者曾尝试通过其他不同方法如微粒栓塞法或物理缩窄股动脉的方法等来制备动物后肢缺血模型,但是目前尚无一个公认的后肢慢性缺血模型,这也影响了对慢性下肢缺血血管新生机理的研究和治疗。本研究用Prolene线线栓大鼠后肢股动脉的方法,制备大鼠慢性后肢缺血模型,不仅可以在较长的时间内维持后肢处于缺血状态,而且组织的病理学改变和血流恢复的动态演变更接近于慢性缺血过程,从而为研究各种治疗手段提供了一个良好的模型基础。通过观察,动物术后无死亡,少有急性下肢缺血的表现如肢体苍白、无脉、麻痹等临床称之为的“5P”征,没有出现后肢坏死。但是,在观察晚期(42~49d)后肢肌肉有萎缩现象,这与临床所见相类似。而1只行左侧髂动脉切除+左股动脉切除术的大鼠,术后第1天即出现患侧后肢的缺血坏死,3d后则死亡。3.1慢性心肌缺血对大鼠血流量的影响利用激光多普勒血流探测仪可以监测皮肤微循环血流量。PU值为激光多普勒血流探测仪测量的基本指标,是一个表示测量深度内局部组织微循环血流量大小的相对单位,PU值的变化直接反应了组织微循环血流量的改变,其与测量范围内的红细胞移动速度和数量密切相关。有研究表明,该项检查可以动态监测急性大鼠缺血模型术后肢体的血流变化。本实验发现,慢性缺血组大鼠出现后肢缺血状态慢、时间晚,但是血流下降的速度却快于急性缺血组,而且后肢缺血状态维持时间长,在术后第49天,其血流量仍为健侧的70%;而急性缺血组在术后第49天,其缺血状态基本恢复。结合DSA分析,在股动脉插入4-0Prolene线后,在短期内造成了血管内物理性狭窄,此时后肢血流仍未中断,随着血管腔内产生异物反应后,内膜开始增生,随后造成管腔急剧狭窄,最终闭塞,使后肢呈持续缺血状态。3.2慢性心肌缺血对大鼠肢体侧支血管数、形态变化的影响慢性缺血组患侧股四头肌在术后第7天小动脉密度小于急性缺血组,由此提示,线栓股动脉后,小动脉的开放明显少于急性缺血组。DSA结果显示:①急性缺血组患侧肢体远端无主干血管显影,在术后第7天,股部即出现侧支循环开放,表现为患侧侧支血管数量多于健侧,在术后第42天达到高峰。②慢性缺血组在术后第7天,所栓塞的血管基本显影,但存在部分的充盈缺损;在术后第14天仍有部分血管显影,但造影剂颜色变淡,远端显影不佳。侧支循环血管计数结果显示:在术后第7天慢性缺血组未见明显的侧支血管开放,第14天侧支血管增加,在术后第42天,患侧肢体侧支血管数仍高于健侧。分析其原因为:急性动脉闭塞使得肢体缺血区域与非缺血区域血流的压力差(血管剪切力)突然增加,从而导致了侧支血管可以在短时间内大量开放。同时,这种血管剪切力的增加也可导致相应基因的表达。然而,慢性肢体缺血不会突然增加血管剪切力,故侧支血管不会在短时间内开放,因而导致下肢的血流呈缓慢的恢复状态。故如何减少血管剪切力的突然增加是制备慢性缺血模型的关键之一。另外,本实验还观察到肢体发生急性缺血后,相应组织的炎性细胞浸润明显增加。炎性细胞中的单核细胞和巨噬细胞通过在局部释放如单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotacticproten-1,MCP-1)等多种细胞因子,在血管新生中起着重要的作用。故如何抑制缺血后局部的炎性细胞浸润也是能否成功制备慢性缺血模型的关键之一。综合本实验结果及其分析,通过线栓大鼠股动脉的方法可维持大鼠后肢缺血状态6~7周以上,而且较少表现出肌肉的急性坏死。该手术操作简单,组织的病理学改变及形成缺血的过程更接近临床慢性下肢缺血过程。在今后进一步的研究中如何避免血管剪切力和炎性细胞浸润是成功制备慢性缺血动物模型的重点。1.3.2股动脉活检麻醉方法及切口位置同上,于腹股沟根部分离出股动脉和股静脉。分别于股动脉近、远端阻断股动脉及股