mela1、mel1b、mel1b在大鼠中枢神经系统的表达及分布差异

mela1、mel1b、mel1b在大鼠中枢神经系统的表达及分布差异

mt是一个重要的信号材料，其生理功能和作用机制引起了研究人员的注意。目前认为,褪黑素在细胞膜上与G蛋白耦联的褪黑素受体起作用。依据其受体亚型的不同,褪黑素的作用途径至少有两种:一种是通过与抑制型G蛋白(Gi蛋白)耦联的Mel1受体;另一种途径是通过与Gp蛋白耦联的Mel2受体。褪黑素受体在体内的分布很广泛。最多的研究是利用放射性配体位点结合试验,但因缺乏高度专一性的放射性标记配体,褪黑素受体在体内的分布仅根据其与选择性较低的放射配体2-125I-MEL结合的特性来确定。比较确认的结果显示Mel1受体在视网膜、交叉上核(SCN)、室旁核(PVNT)、四叠体(SC)、结节部(PT)等处含量较高;Mel2受体主要分布在仓鼠脑内、睾丸和肾脏及小鼠脑内。更为精确的研究是利用原位杂交的方法分析褪黑素受体的分布,不过报道较少。本研究采用地高辛标记的cDNA探针进行原位杂交,对褪黑素受体Mel1a和Mel1b在大鼠脑内的分布进行研究,为研究褪黑素的作用机制提供一些形态学资料。材料和方法1.主要试剂与仪器Wistar大鼠25只,雌雄不拘,体重180～220g。Mel1apSP72质粒、Mel1bpSP72质粒均为香港中文大学医学院生理系PangSF教授惠赠。主要试剂:HindⅢ、KpnⅠ限制性内切酶为华美公司产品,地高辛标记试剂盒、地高辛抗体均为德国BM产品。显色剂NBT/BCIP为博士德产品。2.ssc的制备地高辛标记的Mel1a、Mel1b探针的制备:质粒经转化、扩增(宿主菌HB101),HindⅢ和KpnⅠ双酶切后分别释放出264bp的Mel1a和242bp的Mel1bcDNA,低熔点胶回收后地高辛随机引物标记试剂盒标记。原位杂交:大鼠经4%多聚甲醛固定,取脑和脊髓置于4%多聚甲醛/30%蔗糖中后固定及脱水,冰冻切片(厚35μm)。Mel1a或Mel1b原位杂交参照Busuttil等方法,组织切片漂洗、消化后在20μl/L杂交液中43℃反应20h(探针100℃水浴10min后,-20℃快速冷却),梯度SSC漂洗后,将切片挑入1∶1000的地高辛抗体4℃过夜,漂洗后,NBT/BCIP显色,脱水封片。阴性对照:(1)以空白杂交液替代含地高辛标记探针的杂交液进行反应;(2)以抗体稀释液代替地高辛抗体进行反应。结果1.阳性神经系统染色法Mel1amRNA和Mel1bmRNA阳性反应存在于多种神经细胞中,典型的阳性神经细胞的轴突、树突和胞浆均为浓染,而胞核不染色,细胞呈空泡状。在不同的脑区和核团,Mel1amRNA和Mel1bmRNA阳性细胞分布存在明显差异(附表)。阴性对照未发现Mel1amRNA和Mel1bmRNA阳性反应。2.mela1mna表达的表达脊髓:在脊髓中MellamRNA(图1)和Mel1bmRNA(图2)均有较高的表达,两者的阳性神经元均主要分布于脊髓灰质第Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ层,脊髓Ⅰ、Ⅱ层阳性细胞极少。小脑及相关核团:在小脑皮层和核团中Mel1amRNA和Mel1bmRNA均有表达,其中Mel1amRNA阳性细胞主要位于小脑浦肯野细胞层(图3)和顶核,染色较浅,其他核团未见表达;而Mel1bmRNA阳性细胞浓染,在小脑浦肯野细胞层(图4)、顶核、球状核和栓状核(图5)中均有大量表达,是中枢神经系统中表达最为丰富的脑区之一。大脑皮层:成年大鼠大脑新皮质有Mel1amRNA和Mel1bmRNA的表达。Mel1amRNA阳性细胞局限于额叶皮层(图6)和额极,而顶叶皮层、颞叶皮层和枕叶皮层表达较少。Mel1bmRNA阳性细胞出现在新皮质的各层,包括额叶皮层、顶叶皮层、颞叶皮层和枕叶皮层(图7),细胞呈浓染。海马:海马是Mel1amRNA高表达脑区之一。CA1～CA4区的大部份锥体细胞呈强阳性。齿状回颗粒层中Mel1amRNA阳性细胞的密度较高,而分子层中阳性神经元较少(图8)。海马也是Mel1bmRNA高表达脑区之一。Mel1bmRNA阳性细胞的分布和Mel1amRNA类似。CA1～CA4区的大部份锥体细胞呈强阳性,形成特征性的“蚓状”标记带。齿状回颗粒细胞层中Mel1bmRNA阳性细胞的密度较高(图9),而分子层的阳性神经元较少。丘脑和下丘脑:视上区是下丘脑中Mel1amRNA阳性细胞较为密集的脑区。其中室旁核Mel1amRNA阳性细胞散在分布于脑室周围,视交叉上核的阳性细胞染色较浅,散在分布,而视上核的Mel1amRNA阳性细胞染色较深,细胞重叠,是视上核中Mel1amRNA阳性细胞最丰富的脑区,但和海马、额叶大脑皮层比仍要少得多。橄榄下核(图10)、缰内侧核(图11)、丘脑外侧核等核团中也发现有Mel1amRNA阳性细胞的分布,但其分布密度均远低于海马和小脑。与Mel1amRNA不同的是,Mel1bmRNA阳性细胞在丘脑的分布非常局限,仅在视上核和交叉上核有少量的阳性细胞分布,其染色深度、细胞密度均比该区的Mel1amRNA阳性细胞少,在室旁核等核团则未发现阳性细胞。其他脑区和核团:Mel1amRNA在面神经核、巨细胞网状核、纹状皮质、三叉神经核(图12)也有较多的表达。mt受体与melaa1受体的基因联系本实验发现,Mel1amRNA主要分布于海马、大脑皮层、小脑皮层、脊髓腹角,在视上核、室旁核、缰核、丘脑外侧核、内侧丘系、外侧丘系及面神经核等也有少量分布。Mel1bmRNA阳性细胞主要分布于小脑皮层和髓质、海马、大脑皮层、脊髓腹角、视上核等。Mel1amRNA在中枢分布广泛、含量丰富,而Mel1bmRNA在中枢分布较为局限,但在海马和大脑皮层这两种受体表达均非常丰富,提示该区可能是MT的两个主要作用部位。以往多采用放射配体结合试验分析MT受体在CNS的分布,结果的精确性受以下几个因素的影响:(1)MT配体的特异性。由于MEL1和MEL2具有相似的激动剂和拮抗剂,利用配体与受体结合的差异来分析MEL1和MEL2受体的分布,其可靠性不能得到保障。较高浓度的MT在与受体结合时,受GABA影响较大。(2)脑区定位的准确性,近来有用RT-PCR和Western-blot方法来研究MT受体在不同脑区的分布,一些大的脑区可以大致准确定位,但一些小的核团较难精确定位,细胞内定位更难达到。以往研究提示SCN和PT(parstuberalis)是MT受体在中枢的主要分布区,最近的研究表明,MT受体在CNS的分布非常广泛。目前MT受体在中枢神经系统的精确详细分布尚未完全明确,已知Mel1a受体在视网膜、SCN、PVNT、SC、PT等处含量较高,这与本实验结果基本吻合,但本实验发现,SCN、PVNT等虽有Mel1a表达,但并不是含量最为丰富的脑区,最为丰富的是海马、大脑皮层、小脑皮层、脊髓腹角等部位,这可能是由于MT受体的蛋白水平和mRNA水平分布本身就不一致。Mel1a和Mel1b都属于能抑制腺苷酰环化酶的同一大类MT受体,两者在结构上非常相似,但两者的mRNA在大鼠CNS的分布却存在较大的差异,提示这两种受体亚型分别介导MT在CNS的不同作用,但具体是哪些作用目前尚不清楚。基因敲除实验揭示,SCN中的Mel1a和Mel1b两种受体与MT结合后能发挥完全不同的作用,编码Mel1a的基因敲除后,脑区2-125I-吲哚MEL的结合部位基本全部消除,提示Mel1a在分布上较Mel1b占优势。SCN的体外培养也揭示,Mel1a受体基因敲除小鼠,MT对SCN点燃的抑制作用消失,而MT对SCN点燃的相移作用却依然存在,很显然,MT的相移作用是由低含量的Mel1b受体介导的,这一点已被RT-PCR实验所证实。综上所述,分布上占优势的Mel1a受体介导了MT对SCN的抑制效果,而低含量的Mel1b受体参与了MT的相移反应。本实验发现,Mel1a和Mel1bmRNA在CNS均有广泛的分布,但Mel1a在分布