猪伪狂犬病防控探讨临床篇

2011年所在团队最早发现了猪伪狂犬变异株，并开展疫苗的研制和伪狂犬疾病的防控工作国际首次报道国内首次报道VirulentPseudorabiesvirus(vPRV)（超强毒）PseudorabiesVirusVariant（变异株）1目前主要从事猪病的临床防控与实验室诊断工作擅长的领域：猪场的免疫程序评估与调整猪疫苗评估的动物实验设计病毒性疾病诊断与综合防控2每个猪场都面临伪狂犬感染的威胁不同猪场和感染的不同阶段的表现如何通过实验室确诊和防控伪狂犬如何科学地发挥伪狂犬疫苗的作用伪狂犬“五步法转阴”与注意事项主要内容3一、每个猪场都面临伪狂犬感染的威胁伪狂犬病毒的特性：1、病毒对外界的抵抗力强从发病猪排泄的病毒，37℃10天，25℃40天，15℃120天仍存活；2、伪狂犬的中间宿主多，散毒方式多样猪最具耐受性，是自然界病毒唯一的贮存宿主。此外，牛、羊、马、狗、猫、鼠等都能被伪狂犬病毒感染并散毒体内可在多个脏器内繁殖，繁殖快。散毒途径多样，可通过唾液、精液等方式散毒4自然感染的途径：经鼻感染和经口感染空气传播老鼠的传播苍蝇的传播虱子传播妊娠猪感染给胎儿的途径：交配时感染病毒的持续感染通过白血球传送病毒（病毒血症时间短，很难检测到）通过神经节传播，很难防控病毒在初感染部位的鼻粘膜，咽喉头粘膜，扁桃繁殖，其次在其附近的淋巴结繁殖。在上部呼吸道繁殖的病毒借助三叉神经，嗅觉神经，舌咽神经到达中枢神经，引起脑炎。增殖的病毒如果到达肺部，在肺部迅速繁殖，引起肺炎。5少量的病毒即可感染大量排毒潜伏感染隐性感染3、病毒在猪体内的特征：6接种病毒量和感染成立（岛田，2006）接种量猪头数发热（日数）ELISA抗体价1.1Log105-0.0082.1Log104+（3）0.5264.1Log104+（5.5）0.6946.1Log104+（7.3）0.8188.1Log103+（5.3）0.784伪狂犬病毒的最低感染剂量只有猪蓝耳的1/30注：任何疾病都有感染的最小剂量，低于最小剂量后猪不会感染，更不会发病；7仔猪感染后短时间内会呈百万倍地排毒PRV接种后病毒分离阳性率与病毒排泄量（岛田，2006）

接毒后天数阳性率（%）12345678910NIA-2株鼻腔5/55/55/55/53/34/42/23/32/22/397口腔5/55/55/54/53/33/42/23/32/23/383直肠2/52/51/51/50/31/40/21/30/21/321膣/包皮1/53/52/53/50/31/40/21/30/21/332感染3-5天的口腔试子和鼻腔试子排毒量TCID50，感染8-17天的口腔试子排毒量Log10TCID50，感染18-25天的口腔试子排毒量Log10TCID50，高峰时空气中的病毒量为Log10TCID50按照极致计算，一头猪感染后的3-5天的排毒量可以感染100万头生猪8被感染猪不表现临床症状，病毒粒子本身检测不到，但感染猪终生带毒。病毒的遗传子潜伏在神经细胞内，当免疫低下时，遗传子再活性化引起在感染。被感染猪表现亚临床症状，这种带毒猪可持续一年以上排毒。

潜伏感染猪和隐性感染猪成为污染源9侵入途径1989年1-3月1989年4-6月合计（%）肥育猪的引进1736539.8繁殖猪的引进1041519.4猪的分群639458.3地域内传播777715428.4野生猪1891.7机械的传播1010.2猪的死体0440.7不明10112222341.1其他0220.4PRV的侵入途径---种猪引进和育肥猪散毒是已知的主要传染源（美国农务省的调查结果）一点式饲养散毒风险大,伪狂犬阴性场引进后备必须经过检测确定为伪狂犬阴性!10综上所述，大多数猪场都存在伪狂犬发病的风险；中小规模猪场的风险尤为突出；小结伪狂犬病毒感染剂量低，中间宿主多，猪感染后排毒量巨大，进入猪场途径多，猪场内传播快，公猪传播途径容易被忽视；11变异株的流行导致发病率持续上升2011年以前，由于疫苗普遍接种（很多猪场仔猪只做一针的情况下）临床典型病例已较少；配合鉴别诊断技术，很多猪场实现了伪狂犬转阴或者净化；12变异株的流行导致发病率持续上升自2011年底自北向南猪场陆续出现伪狂犬；经过鉴定不同省份分离的毒株都是高度同源的变异株；2011年底最初发生的省份至2015年伪狂犬变异株的分布13PRVHeN1和S株对小鼠的LD50测定PRVHeN1和SC株Vero细胞培养液的毒价测定分别为107.6

TCID50;10TCID50/0.1mL。

将原液稀释为10、10、10、10、10、10TCID50/0.1mL；30只5周龄BALB/c小鼠，随机分为6组，每组5只，皮下注射各稀释度病毒0.1mL；逐日观察小鼠症状与死亡情况。

PRV-HeN1株对小鼠的LD50经计算为102.4TCID50/只。

PRV-SC株对小鼠的LD50经计算为10TCID50/只。变异株伪狂犬的致病力更强，致死剂量为国家校检毒株SC株的1/3014Tong,etal.,

Vet.Microbiol.181(2015)236–240.变异株对仔猪的致死率更高15组别绵羊数疫苗株攻击用毒株发病数死亡数保护数保护率A4免疫HeN12/42/42/450%B3未免疫HeN13/33/30/30C4免疫SC0/40/44/4100%D3未免疫SC3/33/30/30注：1、实验设计、免疫剂量和攻毒剂量均参照BarthaK61疫苗质量标准；2、绵羊对伪狂犬感染是致死性的3、免疫是单针肌注免疫现有质量标准的疫苗对变异株(HeN1)的攻毒保护效果欠佳162014年7月-2015年的检测数据统计172016年检测数据统计数据18伪狂犬变异株的临床症状变化初次感染场特别是野毒抗体阴性场，损失惨重。母猪以流产、死胎木乃伊胎为主；仔猪出生后3-5天神经症状，腹泻、呕吐，死亡率100%；伪狂犬野毒抗体呈阴性猪场，迅速转阳，一个月内gE抗体阳率超过50%。感染后1年产房逐渐平稳（但持续感染的影响在继续）神经症状比例减少，腹泻比例增高；保育与育肥猪干咳与继发感染严重；19长期免疫抑制or传胸混感？<1>可致死大量育肥中后期猪<2>母猪屡配不孕，返情率高<3>产房仔猪顽固持续性腹泻<4>猪群精神抑郁具有攻击性20规模化场和中小规模的猪场表现的问题不同规模化场具有较强的处置能力与诊断能力反复加强免疫种猪>4次/年，仔猪>3次/年加大剂量免疫种猪>3头份/次，仔猪>2头份/次实际效果：注射时应激大，多次注射，操作麻烦；可控制临床主要症状（如流产与仔猪神经症状等），但偶有干咳、腹泻等症状120-150日龄猪群转阳率高居不下。21中小规模场主要问题误诊为其他疾病呼吸道症状和繁殖障碍（母猪流产、返情）容易误认为是蓝耳和圆环22伪狂犬引起的腹泻与PEDV症状相近，容易被经验所蒙蔽检测中心二月份采集很多疑似PEDV的病料，最终检测结果为伪狂犬引起的腹泻23近年来伪狂犬发病率高，带毒率高，已成为危害我国生猪养殖的最重大疫病之一；伪狂犬病在呼吸道、消化道、繁殖障碍类疾病中的病原检出率较高，部分症状与蓝耳和PEDV类似；伪狂犬变异株发病重要的特点：必然的几个阶段：流产-木乃伊和神经症状-顽固性腹泻和育肥干咳-长期感染散毒导致育肥期猪群的死亡；感染后的猪场呈亚临床发病，主要问题是仔猪顽固性腹泻和保育与育肥猪干咳。小结24三、如何利用实验室检测防控伪狂犬常用的伪狂犬检测方法：ELISA：gB抗体，gE抗体中和抗体检测病原检测：普通PCR与荧光定量PCR病理切片25三、如何利用实验室检测防控伪狂犬伪狂犬疫苗是少有的可通过抗体检测区分野毒和疫苗毒的疫苗目前大多数伪狂犬疫苗是缺失gE基因的，因此疫苗免疫不会产生针对gE基因的抗体，因此可以通过鉴别诊断技术确定猪场的感染情况。则检出野毒抗体意味着什么？是不是猪群在发病或者仔猪感染？26野毒抗体检测的误区阳性猪场检母猪的抗体伪狂犬一旦感染终生带毒，野毒抗体持续为阳性母猪，不可能通过免疫将野毒阳性的母猪转阴，更不能因为母猪野毒抗体是阳性就判断猪场有问题；阳性场90日龄之前的仔猪判断为伪狂犬感染伪狂犬的母源抗体持续期长，母猪野毒抗体阳性仔猪必为阳性，但不能确诊为野毒感染；27野毒抗体检测的应用范围接种PRVHeN1后，第5天部分猪PRVgE抗体开始阳转，第7天全部阳转。猪场检测PRV野毒是否正在流行应以检测后备猪(14-18周)gE抗体为主，超过15%为正在流行。阳性的母猪可产出阴性的后备，通过这一指标可评价疫苗的保护效果阳性场28野毒抗体检测的应用范围野毒阴性场可用于监测新引进种猪：凡阳性必淘汰，剩余公猪可反复间隔2周检测，均为阴性可用；仔猪按日龄采血，确定猪场的感染阶段，采取针对性措施；29普通PCR和荧光定量PCR样品：扁桃体（持续带毒），肺脏（呼吸道症状），脑组织（神经症状），鼻腔试子（育肥期检测），精液（如血清抗体gE阳性，必检）感染压力评估时用荧光定量PCR误区：伪狂犬的病毒血症期极短，血清样本往往检测不到病原；公猪精液的病原检测容易被忽视病原检测是测序的基础病原检测的误区与应用范围30四、伪狂犬疫苗的作用与正确应用1、伪狂犬病疫苗可有效保护强毒的攻击而免于临床发病。2、弱毒疫苗的保护效果比灭活苗好且免疫持续期长3、伪狂犬活苗注射免疫会受到母源抗体的干扰，滴鼻免疫是有效的免疫途径（1）不受母源抗体干扰；（2）建立黏膜免疫阻止病原经过呼吸道传播途径；4、伪狂犬的母源抗体持续期特别长，在感染压力比较大的场，为尽早肌注免疫，建议在妊娠中后期母猪不要免疫伪狂犬疫苗；5、伪狂犬是少有的几个可以做紧急免疫的疫苗，断奶后仔猪出现伪狂犬引起的干咳与腹泻症状或瘙痒症状，紧急注射伪狂犬可有效缩短病程和发病率；6、对育肥猪注射伪狂犬疫苗，特别是一点式猪场；31五、伪狂犬“五步转阴”法32伪狂犬温和净化的关键点1、疫苗株要能有效压制散毒--不扩大感染压力2、快速产生主动保护----通过佐剂缩短空窗期3、阳性母猪可产阴性后备------阴性后备补充4、控制公猪精液传播----预防再次感染母猪群5、按照产次自然淘汰----逐渐降低猪群的风险6、生物安全灭鼠工作----------保卫净化成果7、配套的检测方法--------评估猪场感染压力33感染压力分析保证后备的阴性阳性母猪随产次自然淘汰定期抗体监测12345伪狂犬“五步转阴”步骤活跃度评估压制散毒后备净化期稳定自然淘汰期验收监测期公猪淘汰与疫苗压制（包括育肥）、生物安全34野毒阳性数/样本数野毒阳性率后备母猪34/4379.07%一产母猪82/10478.85%二产母猪45/5877.58%三产母猪33/5164.71%四产母猪16/2661.54%五产母猪17/2568%六产母猪26/4755.30%七产母猪59/8767.80%种公猪12/2646.15%母猪合计332/44173.02%合计344/46773.66%第一次种猪伪狂犬gE抗体检测情况35调整免疫程序后半年后检测数据猪的种类检验总数抗体阴性数抗体阳性数野毒阳性率后备母猪192（累计）19200种公猪2516936%

一产母猪32718114644.65%二产母猪1883715180.32%三产母猪101208180.20%四产以上母猪82235971.96%合计91546943647.65%36淘汰阳性种公猪后的结果野毒阳性数/样本数野毒阳性率与净化前同产次比较第一次配种母猪3/893.37%降75.7%一产母猪10/1168.62%降70.23%二产母猪23/13217.4%降60.18%三产+四产母猪（净化前零产）167/26463.3%降0.33%五产母猪（净化前一产）54/8169.2%六产母猪（净化前二产）45/5976.3%七产母猪（净化前三产）