趋化因子受体cbccr4抑制剂dd3100对2型登革热病毒诱导血管内皮细胞凋亡的影响

趋化因子受体cbccr4抑制剂dd3100对2型登革热病毒诱导血管内皮细胞凋亡的影响

登革热病毒（dv）和登吉热（df）的病因已经成为一种重要的人类害虫，并威胁到100多个国家的25亿人口。普遍认为2型登革热病毒(denguevirustype2,DV2)流行最广,毒力较强,可引起重症DF,即登革出血热(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克综合征(dengueshocksyndrome,DSS),其主要的特征是血浆渗漏。有报道表明DV引起的宿主细胞凋亡在其致病机制中发挥了重要作用。我们前期研究表明,DV2可通过Fas/FasL途径诱导原代人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinsendotheliumcells,HUVECs)产生凋亡。在后续研究中我们又发现DV2感染HUVECs后趋化因子受体CXCR4(C-X-Cmotifchemokinereceptor4)的基因水平表达增加。CXCR4是人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染的辅助受体,与血管生成密切相关,但其在DV感染血管内皮细胞中的作用尚未明确。本研究采用流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞株Eahy926感染DV2前后CXCR4的表达,并研究CXCR4特异性抑制剂AMD3100对DV2诱导Eahy926细胞凋亡率的影响,探索CXCR4在DV2感染血管内皮细胞中的作用。材料和方法1材料表面1.1血管内皮细胞株的构建Eahy926是由人肺腺癌细胞株A549与原代培养的人脐静脉血管内皮细胞融合构建而成的永生化细胞株,具有血管内皮细胞的特性,为中山医学院干细胞与组织工程研究中心惠赠。1.2病毒DV2病毒株(newguineaCstrain)来自中山医学院微生物学教研室,本实验室已进行病毒扩增和定量保存。1.3bco产品的特性DMEM/F12培养基、胎牛血清、青链霉素双抗等为Gibco产品。凋亡检测试剂盒为南京凯基(含FITC-AnnexinⅤ组份)产品,CXCR4流式抗体为BD产品,Ⅷ因子Ⅰ抗为Thermo产品,Ⅱ抗为上海基因科技产品。2方法2.1胎牛血清及青链霉素双抗Eahy926用100mL/L胎牛血清及青链霉素双抗为1.0×105U/LDMEM/F12培养液,37℃、5%CO2孵育箱中培养。2.2tri数据共享取对数期生长的Eahy926细胞,经4%多聚甲醛固定20min后,0.2%Triton打孔10min,3%H2O2处理10min,5%BSA封闭20min,加抗Ⅷ因子Ⅰ抗,37℃60min,Ⅱ抗37℃30min,DAB显色。2.3流式细胞术检测细胞中eahi986的表达取已定量好的2型登革病毒液(109PFU/L)加入Eahy926细胞培养板中吸附2h,弃去上清,加入培养液,应用抑制剂AMD3100(1mg/L)于感染2h后弃去多余病毒时,加入培养基,37℃、5%CO2培养,在各时点弃去培养液,收集细胞。CXCR4的流式细胞术检测分4个时间点(24h、36h、48h和60h),每个时点设未感染组和DV2感染组。Eahy926的凋亡检测时点设置同CXCR4检测,每时点设未感染组、DV2感染组及DV2+AMD3100组,病毒及试剂浓度参照文献。2.4流式细胞术检测Eahy926细胞的CXCR4表达取对数期生长的Eahy926细胞,500×g离心5min,用PBS洗涤2遍。用buffer重悬并调整细胞数为1×109cells/L吸取100μL转移至5mL的流式离心管中,加CXCR4的流式抗体12μL,室温孵育30min,PBS洗涤2遍后用buffer200μL重悬,流式细胞仪检测。2.5循环流式细胞术检测细胞毒性取对数期生长的Eahy926细胞离心,500×g离心5min,用PBS洗涤2遍。用bindingbuffer重悬并调整细胞数为1×109cells/L吸取100μL转移至5mL的流式离心管中,加入FITC-AnnexinⅤ5μL、PI5μL混匀,室温避光放置15min,加入bindingbuffer400μL,流式细胞仪检测。2.6荧光显微镜观察细胞经DV2刺激及AMD3100处理后,PBS漂洗2次,加含有FITC-AnnexinV的buffer,室温反应5min,荧光显微镜下观察。3统计处理数据以均数±标准差()表示,用SPSS10.0统计软件进行t检验分析。结果1eahy926细胞i-阳性Eahy926细胞经内皮细胞特性Ⅷ因子染色后出现棕黄色的阳性反应,见图1,证实其具有内皮细胞的特性。2农村地区经济发展水平不高,有需要样品的情况Eahy926细胞未感染组设4个时点(24h、36h、48h和60h),各时点表面表达CXCR4的Eahy926细胞百分比分别是:47.23%±17.85%、55.90%±11.48%、45.65%±20.93%和46.23%±21.47%。DV2感染Eahy926细胞各个相应时点细胞表面CX-CR4表达的百分比分别为52.90%±16.28%,58.93%±11.3%,66.13%±10.30%,46.23%±21.47%,与感染前比均上升,其中48h组感染前后差异最明显(P<0.05,n=3),见图2、3。3dv2+dm三和eayn98细胞凋亡率图4结果显示DV2感染组4个时点(24h、36h、48h和60h)Eahy926细胞凋亡率分别为:25.18%±8.82%、29.85%±15.78%、19.95%±4.96%和29.29%±10.08%,均高于未感染组的Eahy926细胞凋亡率(18.95%±9.00%、22.92%±13.06%、18.91%±2.37%和25.73%±9.35%)。而DV2+AMD3100组各时点Eahy926细胞凋亡率为39.39%±15.94%、30.45%±16.88%、27.46%±8.26%和36.37%±18.86%。48hDV2+AMD3100组Eahy926细胞凋亡率高于DV2相应时点组(P<0.05,n=3),见图4、5。4用免疫荧光法检测郴州感染组和郴州新安3100组aeha2a6细胞表面的脂肪醇酸活性结果显示未感染组绿色荧光标记的磷脂酰丝氨酸极少,DV2感染组及DV2+AMD3100组绿色荧光标记的细胞增多,见图6。dv2诱导血管内皮细胞细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis)或细胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)在维持机体正常发育、清除病毒感染细胞、肿瘤细胞等有着极其重要的意义。Clarke等认为呼肠病毒引起的细胞凋亡可能是由肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand,TRAIL)介导的,Kim等研究表明HIV病毒可上调获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS)易感病人体内抗原提呈细胞的TRAIL从而介导凋亡,Larochelle等曾报道EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)引起细胞凋亡可能是FasL的作用,我们研究发现DV2感染原代HUVECs可通过Fas/FasL途径诱导凋亡的发生,HUVECs感染DV2后CXCR4的基因水平表达增加。为了进一步研究CXCR4在DV2感染血管内皮细胞中的作用,我们选择人静脉血管内皮细胞株Eahy926细胞作为细胞模型。Eahy926细胞来源于HU-VECs,与原代HUVECs相比易于培养且无原代细胞分离培养过程中杂细胞的影响。但Eahy926细胞在长期不断传代培养后是否依然具有内皮细胞特性?我们对其进行了内皮细胞特性Ⅷ因子染色,证实了这一点。CXCR4是基质细胞衍生因子-1(stromalcellderivedfactor1,SDF-1)的特异性受体,属于7次跨膜的G蛋白偶联受体家族。CXCR4与配体SDF-1结合传递的细胞间信号在造血干细胞归巢、淋巴细胞迁移、促肿瘤细胞侵袭、促血管细胞增殖生长等方面发挥着重要作用。有报道表明下调CXCR4的表达抑制了肿瘤细胞的代谢和侵袭性,增加CXCR4的表达抑制了过敏性紫癜血小板的自身凋亡。有报道应用CXCR4的单克隆抗体或其特异性的抑制剂AMD3100可上调Fas等凋亡相关因子的表达。AMD3100是SDF-1受体CXCR4的非肽类阻断剂,能特异性与CXCR4结合而不产生激动作用,阻断SDF-1/CXCR4轴参与的生理过程。本文初步研究了AMD3100对DV2诱导血管内皮细胞Eahy926凋亡的影响。本实验结果显示DV2感染Eahy926细胞后能上调CXCR4的表达,48h升高最为明显。根据SDF-1/CXCR4轴参与的生理过程,其CXCR4于感染后表达增加可能为DV2诱导Eahy926细胞凋亡后的保护性上调。DV2感染可以诱导Eahy926细胞凋亡,其中36h凋亡率增