大竹精子发生和精子超微结构的观察

大竹精子发生和精子超微结构的观察

精子的形态、运动和收缩方式与精子的过程密切相关，并有其自身的特点。这不仅是分类的基础，也是分析不同动物群体之间的亲和力的重要依据。国内外已有大量关于软体动物双壳类精子超微结构及其精子发生的报道。大竹蛏Solengrandis隶属双壳纲(Bivalvia),帘蛤目(Veneroida),竹蛏科(Solenidae),竹蛏属(Solen)。本种个体大、足部肌肉发达、味道鲜美、营养丰富,是重要的经济贝类。迄今为止,人们已对大竹蛏的人工繁殖和育苗技术进行过一些研究,但国内外尚未见有关大竹蛏精子发生和精子超微结构的研究报道。竹蛏科绝大多数的种类具有很大的经济价值,但传统的分类研究往往根据外形、壳长与壳高的比例进行种的鉴定,从而造成分类的困难和混乱。大竹蛏与长竹蛏Solenstrictus两者外形相似,如贝壳均较长,前后端开口,壳质薄脆;前缘呈截形,后缘近圆形,背、腹缘直且相互平行;壳顶不明显,位于最前缘。传统上区别两者主要是依据壳长与壳高的比例,大竹蛏一般壳长约为壳高的4—5倍,而长竹蛏一般壳长约为壳高的6—7倍。本文对大竹蛏精子发生的演变规律及其超微结构进行了详细的观察,并与同属的长竹蛏进行比较,结果将有助于探讨竹蛏科近似种的分类及亲缘关系,为海洋贝类繁殖生物学研究及大竹蛏人工育苗提供理论依据。1透射电镜观察材料于2006年5月购自福州市西营里市场,壳长为9.5—10.0cm。选取5只性腺成熟的雄性大竹蛏,迅速解剖,取其精巢组织,3%戊二醛-1.5%多聚甲醛0.1mol·L-1磷酸缓冲液(pH=7.2)于4℃固定2h,充分漂洗,1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾液固定1.5h,漂洗,铀块染色,乙醇-丙酮梯度脱水,环氧树脂618包埋,超薄切片机切片,切片厚70—80nm,分别经醋酸铀、柠檬酸铅染色,用日立Hu-12A型透射电镜观察并拍摄。数据测量:选取切面完整、正中的细胞10—15个,进行不同发育阶段细胞特征的测量。2生殖鞣发育阶段大竹蛏精子的发生不同步(图1a)。生殖上皮向管腔中央排列着一群不同发育阶段的生精细胞:精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子。2.1核质的组成精原细胞是生精细胞中个体最大的,胞体呈长椭圆形,大小为(7.1—8.5)μm×(5.1—5.9)μm。核内异染色质呈小块状,附在核内膜及稀疏分布在核质中。细胞质电子密度低,含有一些椭圆形的线粒体。线粒体基质电子密度低,嵴稀少似空泡(图1b)。胞质内很少内质网,有高尔基体和小的前顶体颗粒。早期精原细胞经一次有丝分裂形成晚期精原细胞,其明显变化是异染色质块稍变大,线粒体嵴稍增多增长。晚期精原细胞常见核分裂为二,而胞质未分开的现象,形成双核细胞(图1c)。2.2核质内异染色质块初级精母细胞由晚期精原细胞转化而来。细胞近椭圆形,大小为(6.3—7.1)μm×(4.3—4.7)μm。核卵圆形,长径为4.9—5.4μm,短径为3.8—4.0μm。核内异染色质块增大,附在核内膜及不均匀分散在核质中,胞质电子密度增高。椭圆形线粒体分布在细胞的一侧,体积稍增大,基质的电子密度也较前期增高(图1d)。高尔基体发育良好(图1e),由一系列致密平行的扁平囊组成,两端膨大成泡状,其周围分泌有嗜锇的高尔基囊泡。细胞质中可见少量的前顶体颗粒。2.3细胞核尺寸和高尔基体初级精母细胞经第1次成熟分裂产生次级精母细胞,细胞椭圆形,长径约5.2—6.2μm,短径约4.5—5.2μm。细胞核椭圆形,大小约为(4.4—5.3)μm×(2.7—3.2)μm。细颗粒状异染色质已凝聚成大的团块,有的团块开始互相融合。线粒体集中分布在细胞的一侧,极性明显,嵴增多增长,有少量长线状内质网弯曲分布在胞质中。高尔基体更加发达,可见一对中心体发出的轴丝(图1f)。前顶体颗粒数量增多,已经有一些小颗粒融合形成较大的颗粒(图1g)。2.4体积、测定精细胞是次级精母细胞经第2次成熟分裂产生的,体积明显变小。根据其发育过程中染色质凝集状况、前顶体囊及线粒体的形态位置和变化特征,将其分为4个时期。2.4.1异染色质团的制备细胞椭圆形,大小为(3.6—4.5)μm×(2.3—3.1)μm。核较大,核形与胞体一致,大小为(2.5—3.0)μm×(1.8—2.1)μm(图1h)。异染色质团块变大且大部分已联结在一起。线粒体开始融合,数目减少,体积增大,嵴更加发达。同时,细胞质内大量高电子密度的前顶体颗粒逐渐融合,形成圆形的前顶体囊,其电子密度较高且均匀,此时前顶体囊和线粒体位于细胞核的同一侧。随着发育的进行,前顶体囊内的物质开始分化,图1i显示精细胞I期后期形成的前顶体囊,其内物质分布不均,中间区域为较低电子密度的絮状物,高电子密度的物质分布在周缘呈一个带缺口的弧形而不是圆形。2.4.2近圆形高电子密度区域的分布细胞核与I期相比逐渐变为近圆形,长径约为2.2μm,短径约为1.8μm,较精细胞I期小,核内颗粒状染色质变粗。线粒体继续融合,内部基质的电子密度增大,嵴增多增长。同时近圆形的前顶体囊从缺口处开始内凹,高电子密度物质仍分布在周缘(图2a)。线粒体和中心体开始向核后端移动,内凹的前顶体囊则一边变形一边向核前端移动(图2b)。2.4.3密度、大小及其分布细胞形状大小与Ⅱ期相似,核变小,较Ⅱ期拉长。细胞核长径1.7—2.3μm,短径1.8μm。异染色质颗粒进一步增大,密度增高,粗颗粒状染色质完全连为一体。线粒体继续融合,基本成形并到达核后端,近远端中心粒移至线粒体间(图2c)。前顶体囊继续内凹,且其内物质均质化、密度增大,形成马鞍形的前顶体,并迁移至核前端(图2d)。最终前顶体、细胞核、线粒体三者位于一直线上。前顶体临核面中央向内凹形成亚顶体腔,内含低电子密度的物质。2.4.4长径、短径、长径生长图1333精细胞胞质减少,体积缩小,形态与精子相似。细胞核进一步浓缩变小成子弹形,长径为1.7—2.0μm,短径为1.4—1.5μm。核内粗颗粒状染色质进一步浓缩,成为高电子密度的均质物,可见少量核泡。顶体基本形成,细胞质作为遗留物大部分被排弃,仅留一薄层波纹状的细胞膜围绕着精细胞(图2e)。2.5克氏原螯虾精子的结构在透射电镜下大竹蛏成熟精子为原生型,由头部、中段和尾部3部分构成(图2f)。头部由顶体和细胞核组成,长为2.0—2.2μm。顶体位于头部最前端,较短,约为核长的五分之一,呈倒置的碗状,其轴向纵切面观为马鞍形,长约0.45μm,最宽处约0.50μm。顶体颗粒为均匀的高电子密度物质。亚顶体腔位于顶体中央,几乎到达顶体的顶端,内含低电子密度的亚顶体物质。细胞核顶端窄而底部宽,外形似子弹头,长为1.7—1.8μm,顶部最窄处为0.3—0.4μm,底部最宽处为0.7—0.9μm。染色质高度浓缩,电子密度高而均匀,可见少量核泡。细胞核前端未形成核前窝;但核后端有一浅的核后窝,是近端中心粒嵌入细胞核的部位(图2g)。精子头部与质膜间往往有少量的细胞质,质膜呈波纹状。中段较短,长约0.8μm,最宽处约1.6μm。主要结构由线粒体围绕中心粒复合体形成。中段横切面上可见4或5个椭圆形线粒体围绕在远端中心粒周围(图2i和图2j)。线粒体长径约为0.8μm,短径约为0.65μm;嵴发达、长而密,清晰可见。线粒体与质膜间的细胞质区域有明显的糖原颗粒。中心粒复合体由相互垂直的近端中心粒和远端中心粒组成,横切面显示为“9+0”的结构(图2g),近端中心粒直径约为0.20μm,远端中心粒直径约为0.20μm,长约为0.28μm。远端中心粒后端外围向四周发出9条辐射状电子致密带形成的卫星体结构(图2k)。尾部细长,在光学显微镜下测得其长度为50—55μm,由轴丝和质膜组成,轴丝由远端中心粒发出,为典型的“9+2”型结构,由中央的两个单根微管和周围的9个成对微管组成(图2h)。3小鼠精子的超微结构动物的精子发生特别是精子结构可以在一定程度上为研究物种间的亲缘关系、系统分类提供有利的证据。近年来国内外不少学者对软体动物精子超微结构做了比较研究,如Hodgson等对贻贝科3种动物精子的超微结构进行比较;邓道贵等比较了双壳类9种动物精子的超微结构;柯才焕等对鲍科杂色鲍Haliotisdiversicolorsupertexta、盘鲍Hdiscusdiscus、皱纹盘鲍H.discushannai精子的超微结构进行了详细比较,都认为精子的细微结构如顶体和核的大小、比例及外形可以作为种间鉴别的依据。本文主要从以下几个方面比较大竹蛏与同属的长竹蛏的精子发生和精子超微结构,以期为利用精子超微结构进行竹蛏科的系统分类提供依据。3.1高电子密度区域的分布大竹蛏精子发生的过程与多数软体动物双壳类一样,依次经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子几个阶段。软体动物的顶体形成过程一般由高尔基体分泌的嗜锇液泡或囊泡(也称为前顶体颗粒)逐渐融合为前顶体囊,并迁移至核的前端,前顶体囊内凹变形,密度不断增加;最终发育为前顶体。大竹蛏和长竹蛏的顶体发育过程基本相似,前顶体囊为近圆形,其内物质分布不均,周缘呈现高电子密度,中间区域则呈现较低电子密度。不同的是大竹蛏精细胞前顶体囊的高电子密度物质分布在周缘呈一个带缺口的弧形而不是圆形,此后前顶体囊正是从此缺口处开始内凹;而长竹蛏前顶体囊周缘的高电子密度物质呈一圆形分布。多数双壳类的前顶体囊是在到达核前端后才开始变形,而大竹蛏的前顶体囊则是先内凹变形,然后一边变形一边移动,到达核前端时前顶体基本形成,这与长竹蛏及其他双壳类精子顶体的发育有明显的不同。但翡翠贻贝Pernaviridis的顶体发育却同时存在两种情形,既有边移动边变形的情况,又同时存在先移动后变形的情况。另外,长竹蛏生精细胞的内质网活动十分旺盛,从早期精原细胞一直到次级精母细胞都可见到发达呈长索状的内质网,至精细胞早期内质网逐渐消失。大竹蛏精子发生过程中,精母细胞期和早期精细胞可见发达的高尔基体及分泌的囊泡和明显的前顶体颗粒,到早期精细胞时已融合形成圆形的前顶体囊。与长竹蛏不同的是,大竹蛏生精细胞内质网的活动不是十分旺盛,在精原细胞和精母细胞期很少见到发达呈长索状的内质网。此外,在精子发生过程中,大竹蛏精核形态由长(精母细胞期)到圆(精细胞Ⅱ期),继而又拉长(精细胞Ⅲ之后),与长竹蛏的精核变化(由长到圆)也是不同的。因此,精细胞分化的细节也是区别外部形态相近物种的依据。3.2两种精子形态的比较双壳类软体动物精子顶体的有无、顶体的大小与形态以及亚顶体腔的形态结构差异可作为探讨种间联系与亲缘关系的依据。大竹蛏成熟精子顶体形态与长竹蛏精子的极为相似,较短,约为核长的五分之一,呈倒置碗状,轴向纵切面观呈马鞍形;其内物质密度高且分布均匀,亚顶体腔内含有均匀的低密度的物质,但大竹蛏的顶体比长竹蛏的顶体稍长。双壳类精子头部另一个重要的结构是细胞核,种与种之间精核的形态结构差异主要体现在其大小、横径与纵径的比例、核前窝与核后窝的有无及结构的不同。大竹蛏成熟精子细胞核顶端窄底部宽,外形似子弹头,而长竹蛏核呈圆球形;两者核形差异较大,但都没有核前窝,而都有浅的核后窝。另外大竹蛏的精核比长竹蛏的稍大、较长,从而进一步证实精核形状和大小是区分相近物种的重要依据之一。大竹蛏精子中段由线粒体围绕近端中心粒与远端中心粒组成,线粒体形态为卵圆形,由内外双层膜包绕,与长竹蛏一样数目为4个或者5个。在大竹蛏远端中心粒周围发现有卫星体结构(图2j),它是由远端中心粒后端外围向四周发出的9条辐射状电子致密带,每条致密带的末端与质膜及线粒体相连,以加强鞭毛与精子头部的连接。菲律宾蛤仔Ruditapesphilippinarum和Anadaragranosa也有此结构。但在长竹蛏精子超微结构的观察中未报道卫星体结构的存在。大竹蛏尾部鞭毛细长为50—55μm,明显较长竹蛏的鞭毛长;与此相应两种蛏精子头部占精子的比例也有差异:大竹蛏精子全长52—57μm,头部为2.0—2.2μm;长竹蛏精子全长38—43μm,头部长约1.8μm。这与柯才焕等在比较研