大鼠下肢急性缺血后血流、血压及肌肉组织的动态变化

大鼠下肢急性缺血后血流、血压及肌肉组织的动态变化

据统计，在美国，每年15万人无法接受干预和手术，因为下肢严重缺血。但随着再生医学的发展,Isner等提出治疗性血管新生(therapeuticangiogenesisTA)的概念,即将外源性血管新生诱导因子转入缺血组织中以促进血管新生和侧支循环的建立。在血管外科,近几年来骨髓来源干细胞治疗慢性下肢缺血已成为一种治疗缺血性疾病新的尝试。基于此,肢体缺血模型的建立对于TA的效应研究尤为显得重要。本实验对目前常用的下肢缺血模型的血流和血压动态演变及肌肉组织改变进行系统观察,以探索动物模型的最佳条件,为后续的干预实验打下基础。1材料和方法1.1激光多普勒血流检测仪器1SPF级雄性Lewis大鼠10只,平均体质量约300～400g,由北京维通利华实验动物中心提供。激光多普勒血流探测仪,激光多普勒血流成像仪(购自瑞典百灵威医疗仪器中国公司);显微基础手术器械,血管造影机为美国GE医疗器械公司产品。1.2实验方法1.2.1规备皮消毒实验动物经10%水合氯醛溶液4μL/kg腹腔注射麻醉,仰卧固定,左下肢常规备皮消毒。纵行切开左下肢正中的皮肤,于腹股沟下分离出股动脉,范围从腹股沟韧带直至膝关节。在腹股沟韧带下切断股动脉,双重结扎近端,随后向远端锐性剥离至膝关节,结扎股动脉于股部的所有分支,并结扎腘动脉及腓动脉。术毕,缝合切口。1.2.2手术后观察指标和方法1.2.2.患下肢肢体评估术后2,7,14,42,49d对每只动物情况的评估:包括患肢活动状况、肢体颜色、温度、有无溃疡、有无足趾坏疽及脱落等。0=正常,1+=患肢苍白,2+=血压下降,3+=坏死或者间歇性的跛行。1.2.2.根据《血食数据分析》h术后2,7,14,42,49d,每次取大鼠2只,常规麻醉后,在室温26℃相对恒定下,分别于动物的足底放置激光探头,连续测量基础5min;记录双侧血流基础值(PU值),计算患侧/健侧比率。随后于双下肢股根部外加宽1.2cm袖带的同时,足底放置激光多普勒探头。袖带加压至200mmHg(1mmHg=0.133kPa)后,逐渐减压。在持续减压的同时记录血流变化情况,以血流开始恢复的起点所对应的血压值为该侧肢体收缩压;连续测量3次取平均值为患侧和健侧血压值。同时对手术侧与非手术侧血压及血流的比值进行动态观察。1.2.2.下肢血管造影于术后2,7,14,42,49d时间点分别取2只实验动物,常规麻醉动物后开腹,切开后腹膜行腹主动脉留置套管针,充分注射肝素生理盐水后,通过腹腔注射水合氯醛溶液5～7mL处死动物并固定体位。以2.5mL/s的速率注射造影剂(泛影葡胺)共5mL进行下肢血管造影,对双下肢连续拍照,用数字减影的方法处理造影结果。结果分析:以腹主动脉分叉处显影后1.5s时摄片为依据,计算通过右股骨中点垂直线的血管数目,表示侧支血管开放的程度。(由两位独立的观察者对垂直通过股骨中点的侧枝血管进行计数)。术毕,取大鼠双下肢股四头肌,腓肠肌,甲醛固定后行用石蜡包埋连续切片,每张切片用苏木精及伊红染色。1.3组间比较方法采用SPSS11.5统计软件对实验结果进行分析,各组计量资料以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。组间比较采用方差分析或两独立样本均数的t检验,各组间率的比较采用χ2检验。检验显著性取α=0.05,P<0.05为差异有显著性。2结果2.1手术侧肢体腐烂所有动物成活。可观察到部分动物出现后肢缺血表现,如后肢跛行(2例),发绀2例,苍白3例,肌肉萎缩1例。但是未发现手术侧肢体坏死和溃疡。术后2周内均分为2+,在49d均分为1+。2.2术后恢复至对侧肢体的30d患肢血流术后7d下降,术后28d下降至最低点(正常侧肢体的40%);术后49d恢复至对侧正常肢体的90%以上(图1A)。术后2d血压明显下降,14d下降到最低点,后逐渐恢复;至术后49d基本恢复正常(图1B)。2.3股部血管数量分布术后2d缺血侧远端无血管显影,患肢在术后7d,股部即出现侧支循环开放,表现为患侧小血管数量多于健侧;在术后28d达高峰,患侧血管数量显著高于健侧;术后49d两侧侧支血管数量基本相同(图2-3)。2.4因血中实物测定sda大鼠后肢肌肉组织学HE染色可见:大部分肌肉组织未出现明显的坏死。少数(4例)表现为:术后早期(2d)缺血肌肉部分出现点状坏死,在胞浆中现均匀一致(图4A);至中期(14～28d)出现肌肉结构破坏,期间大量炎性细胞浸润(图4B),后期(42～49d)后肢的肌肉出现萎缩,表现为肌间隙明显增加(图4C)。3术后大鼠肢体活检情况目前国内外普遍采用急性后肢缺血动物模型,制备主要是通过结扎股动脉、髂外动脉、或剥脱股动脉以造成后肢的急性缺血,一般认为,在急性缺血的后期是慢性缺血过程。在血管新生的机制中,认为急性缺血后,局部产生的剪切力、炎性反应、内皮主细胞的局部浸入;以上三大机制都在短时间内参与血管新生和生成。急性缺血是肢体缺血模型的主流,应用最为广泛。其制作方法大体上以结扎并切除后肢的供血动脉主干或其分支为主。但是,在大多数的实验动物中,如果结扎并切断某一支供血动脉的近端,通常引起远端肢体缺血坏死的情况并不明显,因而新的动物模型也不断出现。本实验采用切断后肢股动脉的方法制备急性缺血模型,术后动物较少出现急性下肢坏死,分析其原因可能与大鼠后肢供血动脉分支之间以及盆部与下肢动脉分支之间存在丰富的吻合有关。故即使结扎甚至剥离下肢股动脉,大鼠仍不会表现为严重的缺血,但血流和血压的测定却可发生缺血明显的变化。本实验对动物模型进行为期49d的观察,可以看到患肢的血流在术后7d即出现下降,术后28d下降到最低点,术后42d恢复到对侧(正常肢体)的90%以上。术后28d为最低,术后42d基本恢复正常。术后42d侧支循环开放达到高峰。总的来说缺血的时间仅能维持4～6周。患肢血压在术后2d明显下降,14d血压下降至最低点,后逐渐恢复,分析此结果的原因:一方面可能与啮齿类动物自身的生理特点有关;另一方面,在后肢急性缺血状态下,急剧增加的血管剪切力和局部点状坏死后炎性细胞的浸润(许多炎性细胞是多种血管生长因子的重要来源),造成了侧支血管在短时