砂浆中汞的生物可接受性研究

砂浆中汞的生物可接受性研究

朱沙是皇家磺酸之一，主要含有硫化银（hgs）。朱沙作为一种药物在中国已有几千年的历史。近年来，一些科学家（长期、超额过低、不规范）合理使用朱沙或复方制剂引起的副作用或慢性中毒的报道被报道。朱沙的药物安全性受到高度重视。朱沙的主要化学成分，硫化银（hgs）很难溶于水，也很难吸收进入体内。除了hbs外，一些可溶性药物（hg2+）和游离汞（hg）也可以在水中溶解。胃肠道很容易被消化，这可能是其治疗效果或毒性的真正来源。因此，整体重量法是用来评估朱沙和中药中含砂量的安全性。研究朱沙中可利用的液体扩散和排泄，对于评估朱沙的药物安全性非常重要。作者采用外部消化透析法模拟人体胃肠道环境，测定朱沙中的液体受体，测定朱沙中的液体吸收和排泄规律，为临床安全药物的提供依据。1实验部分1.1实验仪器和试剂F732-S冷原子吸收光谱仪(上海华光仪器仪表厂),pHS-3C型酸度计(上海精密科学仪器有限公司),ER-182A全自动电子天平(十万分之一,日本A&D公司),Easypure纯水系统(美国Barnstead公司),THZ-82型恒温振荡器(常州国华电器有限公司).朱砂(成大方圆药房),胃蛋白酶(活度1∶3000,美国华美生物工程公司),胰蛋白酶(活度1∶250,美国华美生物工程公司),猪胆盐(BR试剂,北京市海淀区微生物培养基制品厂),其他试剂均为分析纯.透析袋(内径6.4mm,生工生物工程有限公司).实验用水均为超纯水,所用的玻璃器皿经15%HNO3浸泡24h,再用超纯水洗净.1.2外消化分析法测定了朱沙中钙的生物可受刺激性1.2.1消化剂、食蛋白酶液、胆盐的配制重铬酸钾溶液:称取重铬酸钾0.1g,用5%硝酸溶解,并稀释至1000mL.汞标准溶液:精密称取HgCl20.1353g,至100mL容量瓶中,用重铬酸钾溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,得汞含量为1g/L的溶液.用重铬酸钾溶液稀释,分别得到含汞5mg/L和0.05mg/L的溶液.吸收液:称取高锰酸钾3.16g,用超纯水溶解并稀释至1000mL,与1∶9硫酸溶液等体积混合.20%氯化亚锡溶液:称取氯化亚锡10g,用1%硫酸溶解并稀释至50mL(临用前配制).人工胃液:取稀盐酸(9.5%～10.5%)16.4mL,加去离子水定容至1000mL,即得.胃蛋白酶溶液:精密称取胃蛋白酶1.6g,用人工胃液溶解并定容至10mL容量瓶中,得浓度为0.16g/mL的胃蛋白酶溶液,现用现配.人工肠液:取磷酸二氢钾6.8g,加水溶解,用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.8,去离子水稀释至500mL,即得人工肠液.胰液-胆盐(猪胆盐)混合溶液:精密称取胰蛋白酶0.18g、胆盐1.75g,用人工肠液溶解并定容至50mL容量瓶中,得胰蛋白酶和胆盐质量浓度分别为3.6g/L和35g/L的胰液-胆盐混合溶液,现配现用.1.2.2绘制标准曲线分别精密量取0.05mg/L汞标准溶液0(空白管)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6mL置于10mL比色管中,用吸收液稀释至5.0mL,向各管滴加20%盐酸羟胺溶液1～2滴,振摇至高锰酸钾的紫色褪尽,静置20min.将比色管中溶液全部转移至翻泡瓶中,再用0.5mL水清洗比色管,洗液一并倒入翻泡瓶中,分别加入20%氯化亚锡溶液1mL后立即与冷原子吸收光谱仪气流系统联接,并送入流量为1L/min的载气(空气),以空白管调零,读取微安表所示最大读数.据汞的含量与最大读数之间的关系,绘制标准曲线.1.2.3肠吸收环境模拟实验胃消化环境模拟实验:精密称取朱砂0.25g,加入人工胃液25mL,搅拌呈匀浆状,加入胃蛋白酶溶液0.5mL,(37±1)℃振荡100min(150r/min),得胃消化环境模拟实验样品(样品1).静置,离心后取上清液0.5mL,测定汞溶出量.肠吸收环境模拟实验:将胃消化环境模拟实验所得样品(样品1)用1mol/L碳酸氢钠滴定至中性,所需碳酸氢钠体积为1.28mL.将1.28mL碳酸氢钠水溶液加入透析袋中,透析袋置于胃消化模拟实验所得样品(样品1)中,(37±1)℃振荡45min(150r/min),pH约为5.0,向透析袋中加入胰液-胆盐(猪胆盐)混合溶液2.0mL,(37±1)℃振荡100min,收集透析液,得肠吸收环境模拟实验样品(样品2),测定汞透析量.朱砂中总汞含量的测定:精密称取朱砂0.03g,加入1.0mL浓硫酸、0.15g硝酸钾,100℃体外消化3h.测定总汞含量.1.2.4砂出率及生物可接率计算测定汞溶出量、汞透析量和总汞含量,每一样品平行测定2次,取平均值.朱砂中汞的溶出率及生物可接受率公式如下:a=B/A×100%‚b=C/A×100%a=B/A×100%‚b=C/A×100%公式中a、b分别表示朱砂中汞的溶出率及生物可接受率,A、B、C分别表示朱砂中总汞量、胃模拟阶段汞溶出量、汞在肠模拟阶段透析量.1.3朱沙中的汞吸收动力学1.3.1砂混悬液的配制Wistar大鼠(180～250g)24只,雌雄各半(购自中国医科大学实验动物中心).按体重随机分成三组(每组8只,雌雄各半).灌胃给予朱砂混悬液50mg/kg(以0.5%羧甲基纤维素钠配制成7.5mg/kg的混悬液).给药前禁食12h,不禁水.1.3.2不同给药时间点眼后果静脉取血大鼠于给药前和给药后15、30、60、90、120、150min、4h、6h、8h、12h、24h眼后缘静脉取血.第一组大鼠给药后15、90、150min、4h、12h取血;第二组大鼠给药后30、120min、6h、24h取血;第三组大鼠给药后60、150min、8h取血(每次取血0.2mL).血液样品以肝素钠抗凝.1.3.3砂中汞的药动学精密量取血液150μL,加入1.0mL硝酸放置过夜,加入1.0mL去离子水,混匀,高速离心5min(13000r/min),取上清液1.0mL加入0.4mL汞标准溶液(0.05mg/L),测定汞含量.样品中汞含量等于测得量与标准加入量之差.计算每只大鼠不同时间点的血汞浓度,数据以均值±标准差表示.绘制朱砂中汞的血药浓度-时间曲线,计算药动学参数.1.4朱沙中铬的排出研究1.4.1实验动物及分组Wistar大鼠(180～250g)8只,雌雄各半(购自中国医科大学实验动物中心).灌胃给予朱砂50mg/kg.收集每只大鼠0～12h、12～24h、24～48h、48～72h、72～96h的粪样.1.4.2粪样中汞含量测定精密称取粪样0.1g,加入1.0mL硝酸70℃体外消化1h,冷至室温,加入1.0mL去离子水,混匀,高速离心5min(13000r/min),取上清液测定汞含量.测定每只大鼠不同时间段粪样中的汞含量,数据以均值±标准差表示.2结果2.1仪器的检测限和检测限汞在1～16μg/L浓度的范围内吸光度与浓度线性关系良好,回归方程为y=8.791x+7.695(r=0.9973).仪器的检测限为0.5μg/L.朱砂中汞在胃模拟消化环境中的溶出量为94.6±8.7μg/g、肠模拟吸收环境中的透析量为27.1±1.7μg/g、总汞含量为816±19mg/g.经计算朱砂在模拟胃消化环境中的溶出率为0.011%;在模拟肠吸收环境中的可接受率为0.0033%.2.2达峰时间及血药浓度血药浓度-时间曲线:灌胃给予临床剂量的朱砂后,血液中汞浓度随时间的变化曲线见图1.药动学参数大鼠灌胃给予朱砂后汞的达峰时间(tmax)为(1.3±0.4)h,最高血药浓度(ρmax)为(6.3±1.3)μg/L,消除半衰期(t1/2)为(4.2±0.5)h,血药浓度-时间曲线下面积(AUC)为(54.7±8.7)μg·h·L-1.2.3间段粪便中汞的排泄量粪样排泄量:大鼠灌胃给予朱砂后不同时间段粪便中汞的排泄量见图2.朱砂中汞在给药后12h排泄量最大,24、48、72、96h的排泄量逐渐减少.3讨论3.1体外消化透析法生物利用性是存在于一定基质中的目标物经口腔摄入后能够到达体内循环的部分.生物可接受性是指经口腔摄入后,从基体释放到人体胃肠消化道的部分.生物可接受性是生物利用性的最大值,目前已经成为生物利用性的替代测量方法.体外消化透析法是通过模拟人体内消化环境,对营养物质被人体吸收利用部分进行评估的方法.近年来,体外消化透析法已经广泛用于铅、镉、砷等金属的生物可接受性研究.作者参照文献方法采用体外消化透析法测定朱砂中汞的生物可接受性,发现:朱砂在模拟胃消化环境中溶出的汞量远低于总汞含量,说明朱砂中大部分汞都是以难溶的形式存在的;朱砂在模拟胃消化环境中的溶出量远大于其按溶度积(Ksp=1.6×10-52)计算的理论值,表明胃蛋白酶和酸性环境有助于朱砂中汞的溶出;经小肠模拟消化后,汞的透析量更低,大大低于胃阶段溶出率,这可能是由于透析过程只允许分子量小的物质通过,模拟消化过程中汞与蛋白酶或者胰液-胆盐结合形成复合物后就很难通过透析膜.3.2砂浆蛋白的检测血液中95%左右的巯基都存在于红细胞中,由于Hg2+对巯基有高度的亲和力,所以Hg2+可以迅速结合红细胞,同时Hg2+又可与血浆蛋白(富含巯基的蛋白)结合,并与红细胞中的Hg2+形成动态平衡.所以本实验选择全血研究汞在血液中的动态变化规律.血液中汞浓度较低,因此实验中采用标准加入法测定血汞浓度.