精子获能机理的研究进展

精子获能机理的研究进展

能量是饲料精子在精子形成之前必须经历的一个成熟过程。研究表明,经过附睾成熟,精子表面被覆了蛋白和多氨类等对获能有抑制作用的去能因子(Decapacitationfactors,DF),所以,精子离开雄性生殖道后,不具备立即与卵子的受精能力,必须在雌性生殖道内进一步成熟,在形态和生理上发生特定的变化,才具备受精能力。获能精子一旦与精浆和附睾液接触,可去获能,表明精浆和附睾液中都存在去能因子。体外获能和人工诱导受精技术的问世使这一生理学过程得以在体外完成和验证,并为体外模拟获能生理学过程,深入研究获能机制提供便利条件。哺乳动物是人类生活所需畜产品的主要来源,其繁殖效率直接关系到畜牧业的生产效率和畜产品质量,而精子获能效率的提高是哺乳动物受精率和繁殖率提高的前提。获能前后精子发生了一系列理化变化,这些变化为深入探究获能机制提供了重要线索。半个世纪以来,通过对精子获能方法及机制的大量研究,已建立了较为理想的获能技术及评价方法,获能机制研究也取得了一定进展。精子是终端分化细胞,获能过程中不会出现蛋白表达,这几乎已成为繁殖领域众多学者的共识。但是,近几年的研究证明,精子中可能存在蛋白表达,尤其是获能过程中,精子通过线粒体型核糖体进行了Mups蛋白家族等多种繁殖相关蛋白的翻译。随着蛋白组学、生物信息学等的发展,获能前后的差异蛋白不断在牛、猪、鼠、人等物种中被鉴定出来,为进一步揭示获能机制提供了理论基础与技术支持。对人、小鼠等的相关研究表明,蛋白酪氨酸磷酸化(PTP)可促进精子获能,并使超激活运动得以维持;Ca2+、葡萄糖在PTP过程中起到了重要调控作用,但其调控机理还存在争议,对精子磷酸化蛋白功能及相关影响因子的研究有助于深入理解精子获能的发生、超激活运动的维持、顶体反应的发生及精卵结合等受精过程的分子调控机理。为此,本文综述了精子获能前后的变化及已有获能机制的研究结果,总结与分析现有研究的优、缺点,为深化获能机制研究提供参考。1获能反应的因素在雌性生殖道中,精子受到生殖道环境及去能因子等因素的刺激逐渐发生获能反应,在运动轨迹和质膜超微结构及理化特性上都发生了显著变化,以适应新的环境并顺利完成受精作用。1.1膨胀质膜对获能的影响随着去能因子的移除,精子膜结构与机能发生剧烈变化,获能过程被诱发。透射电镜检测发现,经肝素-咖啡因处理的体外获能牛精子膜发生了超微结构变化。精子顶体膜囊泡化,头部核后区核膜膨胀,并与膨胀的质膜相互融合(尾部主段质膜膨胀尤为明显)。由此推测,这些质膜的膨胀会导致离子通透性增加,尤其是Ca2+通透性的改变,一方面使得尾部微管滑动,增加了精子拍打的频率和振幅,导致超激活运动;另一方面Ca2+内流促进了蛋白的酪氨酸磷酸化,推动了获能。电子显微镜观察发现,获能后精子头部侧摆幅度和频率明显增加,尾部振幅加大,鞭毛活动频率加快,运动轨迹偏离线性,呈现超激活运动(HAM)。超激活运动能力的获得使精子能够以最快的速度向目标地点运动,为获能精子顺利完成受精过程争取了时间。1.2能源因子的物理和化学性质的变化1.2.1磷酸腺苷的合成获能前精子以糖酵解为主要能量来源,通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)催化3-磷酸甘油醛生成含有高能磷酸基团的1,3-二磷酸甘油酸,并在磷酸甘油醛激酶作用下将高能磷酸基团转移给ADP生成三磷酸腺苷(ATP)。获能后精子运动加快、代谢增强、耗氧量明显增加,无氧酵解途径产生的ATP无法满足精子对能量的需求,糖酵解和有氧氧化2种供能方式同时启动。作为运动器官的精子尾,其内部线粒体可以氧化磷酸化方式合成大量ATP。ATP合酶(ATPsynthase)位于线粒体内膜基质侧,公认的化学渗透假说认为,底物脱下的氢经呼吸链传递,最终与氧结合生成水所释放的能量,在ATP合酶的催化作用下使ADP与pi发生磷酸化生成ATP。1.2.2顶体酶激活的反应伴随着超激活运动的发生,获能精子中很多相关酶类的活性也发生了巨大变化。随着获能进程,精子腺苷酸环化酶(Adenylatecyclase,AC)、顶体酶和神经氨酸苷酶等相继被激活。胆固醇流失引起的Ca2+、HCO3-内流激活了AC,伴随着细胞外Ca2+、HCO3-内流,胞浆内Ca2+也在向线粒体加速内流,最终胞浆内Ca2+缓慢降低,顶体酶原逐渐活化为顶体酶,激活的顶体酶作用于膜上和膜内相关成分,触发了后续的一系列获能相关反应。其中,酸性磷酸酶(Acidphosphatase,ACP)是精子获能过程中变化最为剧烈的顶体酶类之一,磷酸酶的激活提高了膜脂代谢率,产生大量溶血磷脂,这些溶血磷脂代谢产生的甘油二脂可激活蛋白激酶,通过调控PTP影响精子获能。S.Mack等的体外获能研究表明,获能后4h,ACP活性比获能前降低了2倍,但其他顶体酶类活性并无明显变化。然而获能后ACP活性降低的原理并不清楚。也有研究证明,获能过程中神经氨酸苷酶也被激活,而抑制获能的磷酸二酯酶的活性则被抑制,导致胞内cAMP含量升高,触发了精子细胞内获能相关蛋白的磷酸化,进而促进了精子获能。谷胱甘肽转移酶(GSTs-mu)家族对获能的影响正在成为近几年研究的热点。研究发现,冷冻导致假获能精子增多,同时GSTs-mu5表达增强,而同类研究表明,GSTs-mu5促进了小鼠和仓鼠精子的酪氨酸磷酸化,GSTs家族另一成员GSTs-mu3促进了牛、羊精子获能过程相关蛋白的酪氨酸磷酸化,同时,该研究推测,GSTsmu3的磷酸化对平衡获能过程中精子代谢产生的活性氧有重要作用。1.2.3na+/k+atpase抑制剂伴随着去能因子的去除,Ca2+、HCO3-、K+、Cl-等离子通道相继被激活,诱发了相关离子频繁的跨膜转运,启动了精子获能。因为哺乳动物精子获能表现出Ca2+依赖性,Ca2+在精子获能过程中起着重要作用,所以,在众多精子获能相关离子中,Ca2+变化备受关注。1981年,对海胆的研究发现,获能精子线粒体内Ca2+含量升高,K+含量降低,这种变化增强了精子线粒体内的氧化磷酸化偶联作用,使得产能增加,提高了精子的运动能力。Na+通道也是精子膜上重要的阳离子通道,广泛参与了哺乳动物精子获能。普遍存在于细胞膜上的Na+/K+ATPase(也称Na+-K+泵)以主动运输的形式普遍存在于细胞膜上,每水解1个ATP可以输送3个Na+到胞外,同时输送2个K+入胞,实现了2种离子的主动运输。研究发现,当精子头部膜上的Na+/K+ATPase与其抑制剂乌苯苷结合时,可诱导PTP、精子膜去极化促进精子获能,这说明Na+/K+ATPase与哺乳动物精子获能间存在密切关系,但是,Na+/K+AT-Pase抑制剂的结合却抑制精子活力,这与上述促进获能反应的研究结果相矛盾,所以关于钠通道及钠泵在获能中的作用尚有待于进一步研究证实。获能过程中Na+外流,K+内流,而Cl-在胞体外配体门控和电压门控2个Cl-通道的诱发下发生内流,并且Cl-内流是调控cAMP/PKA(蛋白激酶A)信号通路的上游事件,是必不可少的。精子中存在的电压依赖性阴离子通道(VDAC)蛋白,可能在精子运动、获能和顶体反应等生理活动中发挥重要作用。VDAC家族包含VDAC1~33个亚型。VDAC2和VDAC3位于精子的线粒体外鞘和致密纤维上,参与ATP运输及能量代谢,为精子超激活运动提供能量。研究表明,获能过程中,VDAC会发生酪氨酸磷酸化,促进精子获能,而阻断该通道,精子会失去运动能力。VDAC呈现敏感的电压依赖性,可作为离子通道蛋白调节线粒体膜对离子和小分子的通透性。膜电压接近零时,该通道处于完全开放状态,允许Cl-、K+、Ca2+、Na+、ATP等通过线粒体膜,而当电压>20mV时,该通道则处于关闭状态,通过电压依赖特性,该通道蛋白实现了对精子获能的调节。上述研究结果表明,各种离子流动与获能的关系还不很清楚,尤其是Na+的流动、Ca2+在细胞内外及线粒体间的流动及其引起的相关功能改变还备受争议,因此,对各种离子通道及相互关系的深入研究是揭示获能机制的又一重要内容。2酪氨酸磷酸化系统信号通路、对获能为揭示精子获能本质、提高体外受精效率,精子获能机制成为本领域研究焦点,并且取得了一定进展,现已知胆固醇、活性氧等物质的存在状态和数量的改变对诱发获能反应起到了重要作用,并受到多种酪氨酸磷酸化相关信号通路的调节,对这一系列理化过程的理解,为深入阐明获能机制提供了基础。2.1白bsa调节精子膜胆固醇流失胆固醇外流引起精子膜流动性改变、膜脂类发生重排及胆固醇/磷脂比率下降。质膜膜相的改变,使质膜通透性增加,诱发了Ca2+、HCO3-内流,并使胞内pH升高,触发并促进了获能,最终使精子处于超激活运动状态。研究表明,HCO3-存在情况下,牛血清白蛋白(BSA)能以浓度依赖方式刺激精子膜胆固醇外流,增加精子质膜流动性,诱导获能反应。此外,BSA还可通过形成低水平氧自由基促进获能。甲基-β-环状糊精(MBCD)也可代替BSA引起精子膜胆固醇外流,并通过cAMP/PKA途径促进PTP,最终促进精子获能。此外,MBCD还可直接促使相关蛋白发生PTP,提高精子获能效率。所以,控制精子质膜胆固醇的含量,不仅可调节精子生存力,还可通过调控PTP控制精子获能状态。不同于体外获能,生理状态的胆固醇外流是在雌性生殖道内触发的,去能因子和其他信号分子的作用及其与Ca2+和HCO3-作用的关系,还不得而知,有待进一步探索。目前,雌雄生殖道内均发现有载脂蛋白A1、J和高密度脂蛋白等胆固醇受体,但介导胆固醇由精子膜外流至其受体蛋白的转运体还不清楚,对这些转运体的研究将有利于破解胆固醇外流之谜。2.2透皮尔斯地区获能机理、政策及药物的作用关于获能与蛋白磷酸化关系的研究表明,蛋白磷酸化主要发生在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上,但这3种蛋白磷酸化形式中,酪氨酸磷酸化与精子获能密切相关。酪氨酸磷酸化首先发生在精子尾部,随获能的进行由尾部向头部扩散。同时,AKAP蛋白家族成员AKAP3、AKAP4及PHGPx、P32、PDHA等获能相关蛋白的磷酸化程度与获能呈现时间依赖性。关于信号传导的研究表明,精子中可能存在3种PTP信号传导途径,即可溶性AC/cAMP/PKA途径、受体酪氨酸蛋白激酶途径和非受体酪氨酸蛋白激酶途径,其中第1种途径最为重要。该信号传递路径:Ca2+、HCO3-等信号分子→可溶性AC激活→cAMP含量增加→PKA被PKA锚定蛋白(AKAPs)募集并活化---→蛋白酪氨酸激酶激活→蛋白酪氨酸磷酸化→精子获能。但是,还有观点认为这一信号传导途径是通过丝/苏氨酸蛋白而起作用的,也就是PKA被激活后,首先诱发获能相关蛋白丝/苏氨酸残基的磷酸化,并激活酪氨酸激酶,使酪氨酸残基磷酸化,最终使精子发生超激活运动、顶体反应等获能相关事件。研究证实,鼠精子获能期间PKA活性增加,PKA活性精确地反映了细胞内cAMP的浓度变化,而cAMP不但受AC的调节,还受Ca2+、钙调素和HCO3-的调控,表明cAMP、Ca2+、钙调素、HCO3-在不同层面都与PTP密切相关。获能液中加入cAMP激动剂而不加Ca2+、HCO3-时,精子发生超激活运动、PTP及获能反应,但未达到加入Ca2+、HCO3-的水平,说明除cAMP/PKA信号通路外,Ca2+、HCO3-还通过其他途径调控精子PTP及获能。但有观点认为,胞外Ca2+对PTP有抑制作用,这种抑制作用是通过降低胞内ATP利用率而实现的。从Ca2+分布看,获能前精子头部质膜上Ca2+颗粒多呈集团分布,获能后呈均匀分布,且数量比获能前少,说明诱发获能时发生了Ca2+内流,这种钙离子内流降低了膜表面高浓度钙离子导致的PTP抑制效应。而Ca2+/钙调素(或钙调蛋白)对获能及相关事件的调节作用是双向的,既可通过AC增加cAMP合成,还能通过环核苷酸磷酸酶降解cAMP。研究发现,随获能进程,胞外HCO3-内流增加和同时发生的Na+/H+交换,使精子细胞内pH逐渐升高,HCO3-的内流促进了cAMP的生成,进而促进了PTP进程。Ca2+是促发PTP的关键,所以Ca2+很早就成为获能机理研究的焦点,但随着研究的逐渐深入,其在获能中的作用却倍受争议。虽然大多数学者认为获能过程中胞内Ca2+浓度增加,但也有部分学者认为此过程胞内Ca2+浓度保持不变。同时HCO3-的内流也对促进获能具有重要作用,2种离子在获能过程中的相互关系尚不明了,它们的作用可能会因为物种或者精子细胞所处环境的不同而异。所以,改变细胞环境或许可通过调节这2种离子内流促进PTP,进而促进精子获能。2.3ros,ptp的激活生精细胞及成熟精子细胞上存在低电压调节的Ca2+-T型通道,该通道可在低膜电位时协助Ca2+跨膜转运,为低阈值电压依赖性通道。未获能精子细胞膜去极化,Ca2+-T通道失活,抑制未获能精子发生自发顶体反应。获能过程伴随着膜电位超极化,促使Ca2+-T通道打开,胞外Ca2+内流。I.A.Demarco等提出精子膜上存在Na+-HCO-3协同转运蛋白,HCO-3可直接诱导精子膜的超极化且是Na+依赖性的,但是激活Na+-HCO-3协同转运蛋白的上游信号还不清楚。研究表明,精子膜超极化可活化环核苷酸门控通道(环腺苷酸和环鸟苷酸均可增强该通道的活性),从而引起膜去极化,导致Ca2+通道开放和胞内Ca2+升高。这些变化启动了与PTP相关的信号转导途径而调节精子获能。活性氧是精子氧化反应的副产物,正常情况下,可由抗氧化酶直接清除,当ROS水平超过细胞内抗氧化酶清除能力时,ROS就会腐蚀精子膜表面的多元不饱和脂肪酸,对精子产生毒害作用。当精液中死精子增加时,过量的ROS和精液中的白蛋白可诱发精子质膜发生过氧化反应,降低膜流动性,不利于精子获能,并使精子活动能力降低甚至丧失,抑制受精过程。但是,阻断ROS生成后,人精子无法实现获能,说明ROS是获能所必须的。在获能初期O2-较高,之后缓慢降低至较低水平,甚至比未获能精子水平还低。在获能后45min出现的ROS波峰正好对应精子头部和尾部发生PTP的时间,说明R