两株好氧反硝化菌的分离鉴定及脱氮性能研究

两株好氧反硝化菌的分离鉴定及脱氮性能研究

传统的生物脱氮过程包括两个过程：好氧硝化和坏氧反硝化。然而，近年来的研究表明，反硝化不仅可以在氧气条件下进行，而且也可以在好氧条件下产生。在好氧条件下，可以还原亚硝酸盐或亚硝酸盐，生成氮、氨氮细菌，并被选为好氧抗硝化菌。在好氧条件下，抗硝化的脱氮率为60%。由于好氧抗硝化菌的存在，同时添加硝化和反硝化，这简化了废水处理的过程，但在好氧反硝化过程中，比抗氧反硝化更多的中间产品是坏氧。近年来，煤氮的浓度持续增加，引起了人们的关注。废水生化处理中的硝化和反硝化过程是氮的重要产生源之一。作者以硝酸钾为氮源,采用SBR反应器驯化、富集好氧反硝化菌,通过反硝化性能测定后获得2株好氧反硝化菌,研究其好氧反硝化性能和N2O逸出量.1材料和方法1.1氧反硝化菌的分离用SBR反应器进行污泥驯化.反应器为内径155mm的有机玻璃柱,有效容积12L,底部用微孔曝气头曝气,曝气量可以通过流量计调节.采取瞬间进水的方式,每周期进水6L,以硝酸钾为唯一氮源,保持碳源(以化学需要量COD计)与氮源(NO3-的质量浓度)的比值为10(简称碳氮比,下同),充分曝气,溶解氧质量浓度为2.5～4.5mg/L,曝气反应时间7～8h.驯化初期进水中NO3-的质量浓度为30mg/L,当总无机氮去除率ηTIN达到60%以上时,逐步提高进水中NO3-的质量浓度,直至达到80mg/L,稳定运行若干周期后用于筛选分离好氧反硝化菌.1.2抗硝化菌的初始筛选和抗硝化性能的试验1.2.1培养基和反硝化培养基BTB琼脂营养培养基(单位,L):琼脂20.0g,KNO31.0g,KH2PO41.0g,FeCl2·6H2O0.5g,CaCl2·7H2O0.2g,MgSO4·7H2O1.0g,琥珀酸钠8.5g.BTB试剂(取0.1g溴百里酚蓝溶于10mL酒精)1mL,用1mol/LNaOH调节pH至7.0～7.3.LB液体培养基(单位,L):KNO31.0g,KH2PO41.0g,FeCl2·6H2O0.5g,CaCl2·7H2O0.2g,MgSO4·7H2O1.0g,琥珀酸钠8.5g.DM反硝化培养基(单位,L):KNO30.6g,KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O1.0g,琥珀酸钠2.4g.1.2.2bb培养基筛选将污泥混合液用10倍稀释法稀释后,均匀涂布在BTB培养基上,30℃恒温有氧培养数天后,挑取培养基周围出现蓝色晕圈且形态不同的单菌落作为初筛菌,在平板上划线进行纯菌株的初筛选.1.2.3氧反硝化菌的筛选将初筛菌株活化12h后,以10%的接种量接种到装有100mLDM反硝化培养基的250mL锥形瓶中,30℃恒温摇床培养.摇床转速160r/min.为提高培养液中溶解氧含量,用8层纱布代替橡胶塞封口.每株菌同时进行2组平行实验.每天定时取样,测定培养液中的NO3-和NO2-浓度,分析菌株的反硝化能力,进一步筛选出好氧反硝化菌.1.3气相色谱分析在自制的1L双孔瓶中,加入100mL灭菌的DM培养基,用无菌注射器按5%的接种量接种,以不接种的灭菌培养液为对照组,30℃恒温摇床培养5d,每天取样进行气相色谱分析.采用Varian3800气相色谱仪;10mci63Ni电子捕获检测器(ECD);3m×3mm不锈钢柱,填充固体PorapakQ柱,80～100目.检测器温度为350℃,分离柱温度为50℃,载气流速为20mL/min.1.4no2-测定氨氮采用纳氏试剂分光光度法测定;ρ(NO3-)采用紫外分光光度法测定;ρ(NO2-)采用N—(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定;COD采用重铬酸钾法测定;菌体生长量采用比浊法测定,即用分光光度计测定菌株培养液在600nm处的吸光值(简称OD600).2结果分析经过BTB平板阳性初筛和好氧反硝化性能测试,得到2株好氧条件下,总无机氮去除率高于70%的X1和X2好氧反硝化菌.2.1这两种植物的生理生化特性2.1.1基本生理特征表1为两菌株的基本生理特征.2.1.2菌株生长情况测定将琥珀酸钠、酒石酸钾钠、乙酸钠、柠檬酸三钠、谷氨酸、葡萄糖各取0.1%作为碳源,培养基其他成分相同.用接种环接种对数期的菌液至灭菌后的培养基中,培养15h,通过OD600判断菌株的生长情况.不同碳源条件下,两菌株OD600的测试结果见图1.由图1可以看出两菌株对碳源的利用情况类似.X2菌在多数培养基中的生长情况略好于X1菌.除谷氨酸外,其他5种碳源都是可以被利用,但生长情况一般.2.2生化指标检测图2和图3分别为X1和X2菌以硝酸钾为氮源进行好氧反硝化参数与时间的关系.由图2(a)可以看出:X1菌好氧反硝化过程中,ρ(NO3-)的降低先快后慢,4d后ρ(NO3-)由初始的202.8mg/L降为38.1mg/L.反硝化过程中有一定的亚硝酸盐积累,1d后ρ(NO2-)为32.1mg/L,之后略有降低,4d后为18.5mg/L.这可能是由于硝酸盐还原酶的合成速度快于亚硝酸盐还原酶,从而引起亚硝酸盐的降解晚于硝酸盐.ρ(COD)也随着反应的进行逐渐降低,其变化规律与硝酸盐类似,说明脱氮过程也不断地消耗有机物.由图2(b)可以看出:X1菌培养4d后,OD600达到了0.68,菌株长势良好.在整个反应过程中没有检测到氨氮.X1菌1d后总无机氮去除率为55.8%,第4d则达到72.1%.72h后,总无机氮去除率和吸光度均趋于稳定.由图3(a)可以看出,X2菌好氧反硝化过程中,ρ(NO3-)逐步降低.培养4d后,ρ(NO3-)从初始的203.4mg/L降为42.3mg/L.X2菌在反硝化过程中几乎没有亚硝酸盐的积累.由图3(b)可以看出,X2菌培养4d后,OD600达到了0.70,菌株长势良好.1d的ηTIN为42.8%,此后不断增加,4d的ηTIN为78.9%,高于X1菌.2.3亚硝酸盐还原酶由于两菌株好氧反硝化过程中亚硝酸盐的积累情况不同.用KNO2代替KNO3为氮源,研究菌株X1和菌株X2利用亚硝酸盐氮进行好氧反硝化的情况,实验结果见图4.从图4可以看出,X1菌亚硝酸盐氮的去除能力较差,4d后总无机氮去除率仅为16%.X2菌在第1d的ηTIN也较低,之后增长迅速,4d的ηTIN为73%.将这组试验的结果,与2.2节中出现亚硝酸盐积累情况进行对比,可以推测,X1菌不易诱导产生亚硝酸盐还原酶,易出现亚硝酸盐的积累.2.4e,na2e的逸出量测试两菌株在好氧反硝化过程中产生的N2O,实验结果见图5.可以看出好氧反硝化过程中X1菌的N2O逸出量较多,达到15.3mg/m3,而X2菌N2O逸出量很少,约为1.1mg/m3.两菌株N2O的逸出量与NO2-积累呈现一致性,因此推测NO2-的积累是导致N2O产生的主要原因.2.5碳源种类对菌株时代的影响碳氮比、ρ(NO3-)、碳源种类和pH值都是可能影响N2O逸出量的因素,为考察这些因素的影响,分4组进行实验,见表2.菌株X1、X2在4组实验中N2O逸出情况见图6和图7.由图6(a)可以看出,菌株X1在4组实验中,24hN2O逸出量均很少,48h出现较大增长,第4组实验N2O逸出量最大.1组和2组实验只改变了碳源种类,但N2O的逸出量不同,可见碳源对N2O逸出量有所影响.2组和3组均是采用柠檬酸三钠做碳源,ρ(NO3-)、碳氮比及pH不同,但N2O逸出量差别不大.由图6(b)可以看出,在4组实验中,菌株X2的N2O逸出量均随时间的延长而增加,第4组实验N2O的逸出量最高,其碳源为琥珀酸钠.图7为菌株X1在三种不同碳源条件下的N2O逸出量.由图可看出,琥珀酸钠做碳源时N2O逸出量最多,其次为柠檬酸三钠,酒石酸钾钠做碳源N2O逸出最少.3好氧反硝化过程通过控制反应器曝气强度和硝态氮负荷驯化活性污泥,有利于实现好氧反硝化菌的选择和富集.在此条件下筛选出的两株好氧反硝化菌,均能在完全好氧的条件下以硝酸