生物选修一大肠杆菌的培养和分离

1-1什么是生物技术生物技术=生物工程应用自然科学及工程学原理，以微生物体、动物体、植物体或其组成局部作为生物反响器将物料进行加工，以提供产品来为社会效劳的技术。1-2传统生物技术传统生物技术指主要通过微生物的发酵来生产商品.如:酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等1-3现代生物技术一般而言，現代生物技术可以分成以下五种：一、细胞工程二、发酵工程 三、蛋白质工程四、酶工程五、基因工程

现代生物技术与传统生物技术的本质区别是现代生物技术中用到了基因工程。

一、细胞工程

按照人们的需要和科学设计改变细胞的遗传根底，并通过细胞(组织)培养，细胞杂交(融合)，核移植和胚胎移植等技术，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。二、发酵工程

微生物的无氧呼吸叫发酵1.定义：利用DNA重组技术对不同生物的遗传基因，根据人们的意愿，进行基因的切割、拼接及重新组合，再转入生物体內，产生出人们所期望的产物或创造出具有新的遗传特征的生物类型。蛋白质工程主要包括了解合成蛋白质的DNA编码序列、蛋白质的别离纯化、蛋白质的序列分析和结构功能分析、蛋白质结晶和结构力学分析等。三、蛋白质工程

酶工程即利用基因工程等手段，改变酶或蛋白质的折叠方式、空间结构、催化活性和稳定性等四、酶工程选修1需学习的实验〔微生物的利用〕实验1大肠杆菌的培养和别离〔酶的应用〕实验4果汁中的果胶和果胶酶实验5加酶洗衣粉的使用条件和效果实验6α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测〔生物工程在食品加工中的应用〕实验8果酒及果醋的制作实验实验10泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定〔浅尝现代生物工程〕实验11植物的组织培养实验1大肠杆菌的培养和分离第一局部:微生物的利用一、根底知识1微生物2培养基3无菌技术二、实验操作2微生物的接种技术1操作步骤微生物包括哪五类：病毒细菌和蓝细菌放线菌真菌原生动植物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一根底知识〔一〕微生物细菌的外形与大小细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色〔革兰氏染色〕后显微镜观察A.球菌B.杆菌C.弧菌革兰氏染色革兰氏染色是一种用于细菌的染色法。革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保存染色液的颜色相反细菌的构造图细菌的结构细胞膜拟核细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌〔纤〕毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。*细胞壁成分：肽聚糖细胞壁有哪些功能？①固定细胞外形；

②保护细胞免受外力的损伤；

③阻拦大分子物质进人细胞；④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜〔如温度、水分适宜〕的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌落特征因种而异细菌的营养物质碳源

有机、无机 氮源

有机、无机水无机盐生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶大肠杆菌的培养与别离实验目的:1.进行大肠杆菌的扩增，利用LB液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的别离,用固体平板培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理A.球菌B.杆菌C.弧菌对链霉素敏感大肠杆菌根底知识：由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌：革兰氏阴性菌：细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素。对青霉素更为敏感。细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素大肠杆菌是革兰氏阴性菌，异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道对人无害，但进入人的泌尿系统便会产生危害。大肠杆菌在基因工程中广泛应用，它的质粒是最常用的载体，也是基因工程中常用的受体细胞。大肠杆菌的培养和别离菌种保存培养基的配制灭菌超净工作台倒平板接种液体培养别离培养氮源

矿质元素生长因子

能源碳源水

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。大肠杆菌培养基：一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线别离。一、大肠杆菌的培养培养基种类液体培养基固体培养基半固体培养基物理状态01选择培养基鉴别培养基目的用途化学成分02合成培养基天然培养基03液体培养基：外表生长均匀混浊生长沉淀生长按物理状态来分用途：工业生产、扩大培养固体培养基：菌落，菌苔按物理状态来分用途：菌种别离、鉴定、计数保存菌种半固体培养基：无动力有动力(弥散)观察细菌的运动、厌氧菌的别离和菌种鉴定按物理状态来分1．液体根底培养基牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，蒸馏水100ml，加热溶解以上成分，冷至40-50℃，调pH值至7.4~7.6，煮沸3-5分钟，补足水分，过滤、分装、高压灭菌。2．半固体根底培养基在液体根底培养基100ml中加琼脂，加热至100℃使琼脂熔化，分装试管，高压灭菌。取出后直立放置至琼脂凝固。3．固体根底培养基在液体根底培养基100ml中加琼脂2-3g，加热至100℃使琼脂化，分装于试管和三角烧瓶中，高压灭菌。取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，琼脂凝固后即成普通琼脂斜面；将三角烧瓶中培养基倾注于灭菌平皿内，凝固后即成琼脂平板根底培养基。选择培养基参加青霉素的培养基:别离酵母菌、霉菌等真菌参加高浓度食盐的培养基:别离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:别离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:别离自养型微生物参加青霉素等抗生素的培养基:别离导入了目的基因的受体细胞按功能来分——添加或缺少某种化学成分用于菌种的别离鉴别培养基按功能来分当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌添加某种指示剂后化学药剂用于菌种的鉴别伊红—美蓝鉴别大肠杆菌大肠杆菌菌落伊红美蓝培养基天然培养基有血清、血浆、和组织提取液〔如鸡胚和牛胚浸液〕。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;天然培养基：按化学成分来分根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;本钱低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:按化学成分来分血清中含有：①多种蛋白质〔白蛋白、球蛋白、铁蛋白等〕②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基〔如血清〕。按化学成分来分不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、氧气、渗透压的要求．细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物：0.5g蛋白胨：0.5gNacl：0.5g琼脂

：1g水:50ml细菌喜中性偏碱，霉菌喜中性偏酸LB固体培养基大肠杆菌菌液〔LB液体培养基〕大肠杆菌培养基：一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线别离。大肠杆菌的扩大培养好氧型将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。本卷须知:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却前方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.二、无菌技术从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作〔1〕对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；〔2〕将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；〔3〕为防止周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；〔4〕防止已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。获得纯洁培养物的关键:

消毒与灭菌

(1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体外表或内部一局部对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？不包括防止外来杂菌的入侵1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min〔日常生活常用〕2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min〔对一些不耐高温的液体，常用于鲜奶的消毒〕

3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源〔双手使用酒精消毒〕4、紫外线消毒消毒的方法：对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒碳酸和煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后用紫外线进行物理消毒〔2〕灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a

灼烧灭菌b干热灭菌c

高压蒸汽灭菌a灼烧灭菌微生物的接种工具(接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧b干热灭菌

160－170℃；1－2h能耐高温的需要保持枯燥的物品(玻璃器皿)C高压蒸汽灭菌

100kPa121℃15-30min通常用于培养基、无菌水的灭菌补充：外表灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以根本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。培养基灭菌★根底培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟★含糖培养基：90℃以上灭菌30分钟★鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次★不耐高温的液体成分：

G6玻璃砂漏斗滤过除菌细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌标本的采集无菌试管、烧瓶的使用3.无菌环境4.接种前准备用肥皂洗手并使用酒精消毒。点燃酒精灯→酒精棉擦拭双手→酒精棉擦拭桌面1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择适宜的方法。〔1〕培养细菌用的培养基与培养皿〔2〕玻棒、试管、烧瓶和吸管〔3〕实验操作者的双手答：无菌技术还能有效防止操作者自身被微生物感染。答：〔1〕、〔2〕需要灭菌；〔3〕需要消毒。思考1配制培养基包器材灭菌菌种扩增倒平板接种、划线培养观察记录实验流程三、大肠杆菌的别离倒平板接种、划线灼烧接种环→取菌液→划线别离烧至暗红接种、划线灼烧接种环→取菌液→划线别离菌液膜接种、划线1、划线别离法为什么通过划线别离可得到单菌落？每划完一个区域要不要灼烧接种环？①④③②一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。(1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操