蛋白质工程课件

蛋白质分子设计第一节:基于蛋白质天然结构的分子设计第二节:全新蛋白质分子设计

第三节:计算蛋白质分子设计

蛋白质分子设计蛋白质分子设计是一门新兴的研究领域，其本身在不断地发展，其内容也在不断地更新。蛋白质分子设计方面的主要内容与研究进展，以及应用分子设计取得的成功实例。蛋白质分子的特殊性蛋白质分子功能的重要性蛋白质分子应用的局限性蛋白质分子结构的脆弱性蛋白质工程与蛋白质设计蛋白质设计及结构与功能关系研究的必要性;蛋白质设计是多学科的交叉领域;蛋白质设计在许多方面取得的显著进展Proteinengineering:bywhichwemeanmutatingthegeneofanexistingproteininanattempttoalteritsfunctioninapredictablewayProteinDesign:whichhasthemoreambitiousgoalofdesigningdenovoaproteintofulfilladesiredfunction第一节基于天然蛋白质结构的分子设计

一、概述蛋白质结构与功能的关系的认识对蛋白质设计是至关重要的，蛋白质的结构涉及一级结构(序列)及三维结构。即使蛋白质的三维结构是已知的，选择一个合适的突变体仍是困难的，这说明蛋白质设计任务的艰巨性，它涉及多种学科的配合，如计算机模拟专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家等的合作与配合。

计算机模拟

基因构建突变蛋白质产品功能分析蛋白质设计循环蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面在蛋白质设计开始之前，要对所要求的活性进行筛选。由于真菌与细胞相对容易处理，因此它们是一个生物活性物质源。由于基因工程的发展，真核基因表达技术的发展使动物蛋白质与植物蛋白质的数目迅速增长，又增加了新的生物活性物质源。蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面

筛选以及纯化蛋白质需要进行细致的表征，测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等。专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的。在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后，可以进行定位突变，但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环。蛋白质三维结构知识的必要性

蛋白质三维结构知识对于蛋白质工程是绝对必要的。目前PDB(ProteinDataBank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。当我们开始对某一天然蛋白质进行蛋白质分子设计时，首先要查找PDB了解这个蛋白质的三维结构是否已被收录。如果PDB中没有收录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。设计目标及解决办法

蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程及蛋白质分子设计都是至关重要的。如果我们想改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表，该表至今仍有参考价值。

设计目标

解决办法热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥增加内氢键数目改善内疏水堆积增加表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换内离子对的置换专一性的改变增加逆转数(turnovernumber)改变酸碱度蛋白质设计的目标及解决办法二、蛋白质设计原理

①内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。②所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。③所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)。④疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面。⑤在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何。⑥对于金属蛋白，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。⑦最优的氨基酸侧链几何排列。⑧结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志。实践表明这是蛋白质设计最困难的问题。三、蛋白质设计中的结构－功能关系研究蛋白质结构－功能关系的重要性定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用

1.根据结构信息确定残基的突变：酪氨酰t-RNA合成酶

2.其他实验方法鉴定功能残基：HIV-1蛋白酶；GM-CSF；

3.利用蛋白质同源性鉴定功能残基：保守残基构象的探测定位突变种类插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法。突变的加和性原则突变蛋白质结构的评估溶解性热力学分析Ｘ射线晶体学及ＮＭＲ谱园二色散方法单克隆抗体探测构象变化结构与功能的容忍度

蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度。Fersht等替换了Barnase的所有内核残基。结果表明23％的突变体保留了酶的活性。Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠。这些结果说明不同的氨基序列具有相近的设计的结构。四.天然蛋白质的剪裁分子剪裁：替换蛋白质分子的一个肽段，或一个结构域1）抗体工程（ChapterVI）2）Rop第二节全新蛋白质设计特征：全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程，合成具有特异结构与功能的新蛋白质。根据所希望的结构及功能设计蛋白质或多肽的氨基酸序列。蛋白质的全新设计内容蛋白质结构的从头设计蛋白质功能的从头设计取得的进展：血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白质、DNA结合蛋白及基于蛋白质的高分子材料。一、蛋白质结构的从头设计二级结构模块单元的自组装配体诱导组装通过共价交叉连接实现肽的自组装：-S-S-；DAB在合成模板上的肽自组装线性多肽折叠为球状结构基于组合库的全新蛋白质设计

二、蛋白质功能的全新设计

蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化。为达到这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质。蛋白质的功能设计１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能２．键合及催化的从头设计３．在全新蛋白质中引入结合位点４．催化活性蛋白质的设计５．膜蛋白及离子通道的设计６．新材料的设计第三节计算蛋白质设计蛋白质设计是一个理论与实验之间的循环。这个循环已经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要进展。计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧链构象的离散化、残基分类(内核、表面、边界)、功能位点设计、专一性、稳定性及序列空间的稳健性预测等方面内容。二、蛋白质的功能设计1）通过反向Mimicking天然蛋白质设计新功能2）键合及催化的从头设计3）在全新蛋白质中引入结合位点4）催化活性蛋白质的设计5）膜蛋白及离子通道的设计6）新材料的设计IntroductiontoStructuralBiology:

prediction,engineering,anddesignofproteinstructuresProteinscanbemademorestablebyengineeringThefactorsthatareimportanttoproteinstabilitycanberevealedbydoingproteinengineeringstudies.Anexample:T4lysozyme(fromtheworkdonebyBrianMathews,Univ.ofOregon).T4lysozyme(a)Isa164-aapolypeptidechainthatfoldsintotwodomains:TheN-terminaldomainisof+type,andtheC-terminaldomaincomprises7shorthelices.(b)Hasnodisulfidebonds(c)HastwoCysresidues,Cys54andCys97(thatarefarapartinthefoldedstructure)T4lysozyme(contd.)Tm(themeltingtemperature)Tm(themeltingtemperature):thetemperatureatwhich50%oftheenzymeisinactivated(ormorerigorously,50%oftheenzymeisunfolded)duringreversibleheatdenaturation.ThehigherTm,themorestabletheprotein.WTT4lysozyme’sTm:41.9°CThermodynamicparametersobtainedfromDSCmeasurementsDSC:DifferentialScanningCalorimetry差示扫描量热法DeterminationofHandSfromDSCCpTThermaldenaturationofaproteinThreemethodstoengineeramorethermostableproteinthanwildtypeT4lysozyme(1)reducingthedifferenceinentropybetweenfoldedandunfoldedprotein.(inpractice,reducingthenumberofconformationsintheunfoldedstate)(2)stabilizingthe

helices.(3)increasingthenumberofhydrophobicinteractionsintheinteriorcore.DisulfidebridgesincreaseproteinstabilityOnewaytoreducethenumberofunfoldedconformationsistointroduceadisulfidebridge.ThegeometryoftheCH2-S-S-CH2-bridgeinproteinsisconfinedtorathernarrowconformationallimits.Thus,deviationsfromthisgeometrywillintroducestrainsintothefoldedstructure.So,pairsofidealpositionsneededtobesoughtinordertoaccommodatedisulfidebridges.Disulfidebridgesincreaseproteinstability(contd.)Threecandidatedisulfidebridgesremainedafterthislongfilteringprocess:3-97,9-164,21-142(bytheway,Cys54wasmutatedtoThrtoavoidtheformationofincorrectdisulfidebondsduringfolding).Disulfidebridgesincreaseproteinstability(contd.)4.8°c6.4°c11°COxidizedmutantsaremorestablethanWT.(b)ReducedmutantsarelessstablethanWT.(c)Thelongertheloopbetweenthecysteineresiduesofthemutantswithsingledisulfidebonds,thelargerwastheeffectonstability.(d)Themutationaleffectswereadditive.Triplemutants:4.8+6.4+1122°CDisulfidebridgesincreaseproteinstability(contd.)GlycineandprolinehaveoppositeeffectsonstabilityAglycineresidueataspecificpositioninaproteinhasusuallyoneconformationinafoldedstructurebutcanhavemanydifferentconformationsindifferentunfoldedstructuresofthesameproteinandtherebycontributetothediversityofunfoldedconformations.ProlineresidueshavelessconformationalfreedominunfoldedstructuresthananyotherresidueGlycineandprolinehaveoppositeeffectsonstability(contd.)AnotherwaytodecreasethenumberofpossibleunfoldedstructuresofaproteinistomutateGlyresiduestoanyotherresidueortoincreasethenumberofProresidues.Results:inT4lysozyme,Gly77->Ala(Tmincreaseof1°C)Ala82->Pro(Tmincreaseof2°C)Glycineandprolinehaveoppositeeffectsonstability(contd.)Thethree-dimensionalstructuresofthesemutantenzymeswerealsodetermined:theAla82->Promutanthadastructureessentiallyidenticaltothewildtypeexceptforthesidechainofresidue82;thisstronglyindicatesthattheeffectonTmofAla82->Proisindeedduetoentropychanges.Stabilizingthedipolesof

helicesincreasesstabilityThehelixdipoleconcept:thepositivechargeisattheN-terminusofthehelix,andthenegativechargeisattheC-terminusofthehelix.Thus,negativeionsareusuallyboundtotheN-terminalendofthehelix.Results,inT4lysozyme,Ser38->Asp(Tmincreaseof2°C)Asn144->Asp(Tmincreaseof2°C)Stabilizingthedipolesof

helicesincreasesstability(contd.)Stabilizingthedipolesof

helicesincreasesstability(contd.)MutationsthatfillcavitiesinhydrophobiccoresdonotstabilizeT4lysozyme,althoughtheymaystabilizeotherproteinsTheeliminationofacavityofthesizeofone–CH2-groupintheproteininteriorstabilizestheenzymebyabout1kcal/mol.Results:inT4lysozyme,Leu23->Phe&Ala129->Val:thesenewsidechainswerehydrophobicandlargeenough,inprinciple,tofillthecavitieswithoutmakingtooclosecontactswithsurroundingatoms.MutationsthatfillcavitiesinhydrophobiccoresdonotstabilizeT4lysozyme,althoughtheymaystabilizeotherproteins(contd.)Inpractice,theywerebothlessstablethanwildtypeby0.5to1.0kcal/mol.Itturnsoutthatinordertofillthecavities,thenewsidechainsinthemutantsadoptenergeticallyunfavorableconformations.Thisintroducesstraininthestructure.Mutationsdesignedtofillexistingcavitiesmaybeeffectiveinsomecases,buttheyarenotlikelytoprovideageneralroutetosubstantialimprovementinproteinstability.ProteinscanbeengineeredbycombinatorialmethodsCombinatorialmethods:alsocalledinvitroordirectedevolutiontechniquesCombinatorialmethods:inwhich,librariesofrelatedproteinsareanalyzedsimultaneously.Bysortingtheselibrariestoselectforaparticularfunction,thesmallnumberofactiveproteinscanbeseparatedfrommillionsofinactivevariants.Proteinscanbeengineeredbycombinatorialmethods(contd.)MethodsofgeneratingcombinatorialDNAlibraries:(a)oligonucleotide-directedmutagenesis,(b)error-pronePCR,and(c)DNAshufflingThemutatedgenesarethenselectedinvivobyconferringafunctiontocells,orinvitrobybindingtoimmobilizedtarget.Themostcommonmethodforinvitroselectionisthephagedisplaymethod.MethodsofgeneratingcombinatorialDNAlibrariesMethodsofgeneratingcombinatorialDNAlibraries(contd.)MethodsofgeneratingcombinatorialDNAlibraries(contd.)MethodsofgeneratingcombinatorialDNAlibraries(contd.)Phagedisplaymethod(1)M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).Phagedisplaymethod(2)Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(contd.)PhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptorAgonists:whichmimicthefunctionofahormonebybindingtoitsreceptorandcausingthenormalresponse.Antagonists:whichbindtothereceptorbutdonotactivatehormone-inducedeffectsPhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)Toidentifypeptidesorsmallmoleculeswhicheitherinhibitorstimulatehormonefunction.Thehot-spotprinciple:asmallnumberofresiduesatabindinginterfacecontributemostofthebindingenergy.Erythropoietin(EPO):acytokinehormonewhichstimulatesformationofredbloodcells.EPOR:erythropoietinreceptorEBP:extra-cellulardomainofEPORPhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)NicholasWrightonandcoworkersusedthephagedisplaymethodstoisolatea20residuepeptide,calledEMP1,whichmimicstheactivityofEPObypromotingdimerizationandactivationofEPOR.EMPIwasselectedbytwocyclesofphagedisplay.Phagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)First,randompeptidelibrariesofthesequenceCX8CweredisplayedasgVIIIpfusions.MultivalentgVIIIproteinfusiondisplaypermittedselectionofweakbindersbyavidity(multiple)bindingtoimmobilizeddimersofEBP.TheseweaklybindingpeptideswereexpandedtotheformofX5CX8CX3andparticularlyrandomizedintheX8residues.FusionofthisnewlibrarytogIIIpyieldedalowervalencyofdisplayandallowedselectionoftightbinders.EMP1,isolatedfromthislibrary,boundtoEBPwithaKdof0.2

MandstimulatedEPORactivityinvivoEachpeptidemonomerformsahairpin,stabilizedbyanintramoleculardisulfidebondDNAshufflingallowsacceleratedevolutionofgenesDNAshufflingallowsacceleratedevolutionofgenes(contd.)DNAshufflingallowsacceleratedevolutionofgenes(contd.)DNAshufflingallowsacceleratedevolutionofgenes(contd.)Thedifferentcolorsidentifytheoriginofeachproteinsegment;Interestingly,thesesegmentsformunitsofsecondarystructure.AmodelbasedontheX-raystructureofoneofthenativeenzymesAdditionalmaterialonEisenberg’s3-DprofilemethodRef:Science(1991),253:164-170

Schematicdescriptionoftheconstructionofa3DstructureprofileSchematicdescriptionoftheconstructionofa3DstructureprofileSchematicdescriptionoftheconstructionofa3Dstructureprofile3-DstructureprofileZ-scoreThereare18kindsofenvironmentclassesTheenvironmentofasidechainisfirstclassedasburied,partiallyburied,orexposedaccordingtoitssolvent-accessiblesurfacearea.Theburiedandpartiallyburiedresidueenvironmentsarefurthersubdividedbasedonthefractionoftheside-chainareathatiscoveredbypolaratoms.Thereare18kindsofenvironmentclassesTheburiedclassissubdividedintothreeclasses,labeledB1,B2,andB3inorderofincreasingenvironmentalpolarity.Similarly,theresiduepositionsinthepartiallyburiedclassaresubdividedintotwotypes,labeledP1andP2inorderofincreasingpolarity.Thereare18kindsofenvironmentclassesTheexposedside-chaincategory,labeledE,isnotsubdividedintopolarityclasses,becausewetreatwateraspolar,andexposedpositionsarenecessarilyinapolarenvironment.Thereare18kindsofenvironmentclassesToaccountfortheslightpreferencesofcertainresiduetypestobeinparticularsecondarystructures,residuesintheside-chainenvironmentclassesarefurtherdistributedintothreesecondarystructuretypes,

helix,

sheet,andother,togiveatotalof18environmentclasses.1140.450.58The3D-1Dscoringtable(Proteins(1991),10:229)Anexampleof3-DprofileScience(1991),253:164-170蛋白质工程在医药工业中的应用第一节医用抗体的蛋白质工程第二节组织纤维蛋白溶酶原激活因子的蛋白质工程

第三节基于蛋白质结构的小分子药物设计第一节医用抗体的蛋白质工程I.抗体的产生和抗体的结构简介

1).多肽组件的随机组合产生大量不同抗体

2).抗原结合的特异性由超可变结构域决定

3).恒定区的作用是稳定抗体分子

4).稳定区介导效应器功能第一节医用抗体的蛋白质工程(续)II.从抗血清到重组抗体III.抗体工程1).鼠-人嵌合抗体2).来自鼠抗体可变结构域骨架区可被人源化3).抗体的三维结构可在计算机上建模1人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。

构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。构建重组表达载体

克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。

人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。2鼠单抗可变区的人源化

尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。

CDR即互补决定区。Ig超变区氨基酸残基的种类和顺序特别多变，这些部位与识别抗原直接相关，为Ig分子的抗原结合部位，故称为互补决定区。

CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。

经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）

人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。

定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。

研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。

定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。

研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。

小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。小分子抗体有很多优点:

可以用细菌发酵生产，成本低;

分子小，穿透力强;

不含Fc，没有Fc带来的效应;

在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;

易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

3小分子抗体FvScFv单区抗体最小识别单位Fab

由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。

把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。(1)Fab

Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv连接肽

Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。

连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。

单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;

在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;

如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。

单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:

一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;

二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。

即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。(3)单域抗体VH

约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。(4)最小识别单位CDR4双特异抗体和多价抗体

双链抗体（Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。

双特异性抗体(bispecificantibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。

即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。

Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLAVHB与VHAVLB交叉连结,形成双特异性抗体。

所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。

抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。

PCR技术;

免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达;

噬菌体表面展示文库技术。5抗体库技术

初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。

它是在PCR技术和PhageDisplay的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与PⅢ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技术

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。噬菌体表面展示系统(phagesurfacedisplaysystem)

噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，该项技术的优点:

将抗体的基因型和表型紧密联系起来;

可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;

抗体基因筛选的范围广;

技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;

适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。

噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。6转人Ig基因小鼠获取人Ig基因：构建人Ig的YAC文库及筛选小鼠胚胎干细胞培养小鼠内源性Ig基因的敲除获得完整人Ig-YACs克隆Ig-YACs克隆小ES细胞的导入含人Ig-YACs的ES细胞移入小鼠胚胎含人Ig-YACs的ES细胞的小鼠胚胎向小鼠体内送还嵌合纯合小鼠的产生和鉴定纯合小鼠制备特异性完全人源化抗体第二节组织纤维蛋白溶酶原激

活因子的蛋白质工程I.有关重组t-PAII.产生t-PA突变体的基本原理III.t-PA蛋白质工程的几个方面

1).减慢清除的t-PA变体

2).血纤维特异性第三节

纤维蛋白溶解药

(fibrinolyticdrugs)使纤溶酶原从Arg560-Val561之间断裂成纤溶酶而促进纤溶，溶解血栓，也称溶栓药(thrombo1yticdrugs)治疗急性血栓栓塞性疾病对形成已久并已机化的血栓难已发挥作用

目前应用的纤溶药主要缺点是对纤维蛋白的作用无特异性，溶解血栓同时可诱发严重出血。组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(cu-PA)有一定程度的特异性，但人体应用仍有出血并发症，半衰期又短。为加强特异性以减少出血并发症，并延长半衰期，采用生物工程学方法研制开发高效而特异的新纤溶药的工作正在进行。C组β溶血性链球菌产生分子量为47kDa的蛋白质能与纤溶酶原结合，形成SK-纤溶酶原复合物，促使纤溶酶原转变成纤溶酶，溶解纤维蛋白。因人体内常有链球菌抗体，尤其是近期有链球菌感染者含量更多，可中和链激酶，故首次剂量宜大以中和抗体。链激酶(streptokinase，SK)

静脉或冠脉内注射可使急性心肌梗死面积减少，梗死血管重建血流。对深静脉血栓、肺栓塞，眼底血管栓塞均有疗效。须早期用药．血栓形成不超过6h疗效最佳。

由人肾细胞合成，无抗原性。肝、肾灭活。临床应用同SK，用于脑栓塞疗效明显。因价格昂贵，仅用于SK过敏或耐药者。不良反应为出血及发热，较SK少。禁忌证同SK。

尿激酶(urokinase，UK)含527个氨基酸残基的丝氨酸蛋白内源性t-PA由血管内皮产生对血栓部位有一定的选择性组织型纤溶酶原激活物(t-PA)对循环血液中纤溶酶原作用弱．对与纤维蛋白结合的纤溶酶原作用则强数百倍第三节基于蛋白质结构的小分子药物设计

I.用DOCK发现先导化合物II.Haloperidol衍生物对HIV-1PR的抑制蛋白质的修饰和表达第一节蛋白质修饰的化学途径第二节蛋白质改造的分子生物学途径第三节重组蛋白质的表达第一节蛋白质修饰的化学途径一、功能基团的特异性修饰

I.

多位点取代

II.单一的限制性取代

III.次级取代二、基于蛋白质片段的嵌合修饰I.嵌合蛋白质—非共价缔合系统

II.二硫键与嵌合蛋白质的形成

III.嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键

IV.嵌合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键

V.通过非肽键形成嵌合蛋白质

一、功能基团的特异性修饰在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的

-氨基或

-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。一、功能基团的特异性修饰1．多位点取代2．单一的或限制性取代

3．次级取代

1．多位点取代(1)常规的氨基保护

(2)亚氨代乙酰基

(3)其他的侧链取代

2．限制性取代

(1)

-异硫氰酸苯酯对

-氨基的选择性(2)羰基二酰肼的亲核取代(3)蛋白醛(4)通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和肽的

-酰胺(5)蛋白醛—由糖的化学氧化产生

3．次级取代(1)与蛋白醛偶联—亲核取代物

(2)与蛋白质活性亲核物偶联—醛取代物

二、基于蛋白质片段的嵌合修饰

通过非共价键相互作用、二硫键、常规肽键(通过化学法或酶法产生)或其他非肽共价键，可以将较小的肽段连在一起，这就是通过半合成对蛋白质进行工程操作的原则。二、基于蛋白质片段的嵌合修饰1．通过非共价缔合系统产生嵌合蛋白质2．二硫键与嵌合蛋白质的形成3．嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键4．融合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键5．通过非肽键形成嵌合蛋白质

第二节蛋白质改造的分子生物学途径一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.

编码基因的专一性位点突变

2.

区域性定向突变

二、基因融合和基因剪接1.

利用基因融合技术表达外源基因的缘由

2.

基因融合的策略

3.

产生蛋白质分子嵌合体的方法

4.

蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接

三、tRNA介导定点搀入非天然氨基酸基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。可以这样说，PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。

1．编码基因的专一性位点突变

专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。

(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素

(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法

①Kunkel突变法②基于抗生素抗性“回复”的突变方法③基于去除特定限制酶切位点的突变④利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变2．区域性定向突变

基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法(cassettemutagenesis)，又称片段取代法(DNAfragmentreplacement)。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。研究目的

通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。二、基因融合和基因剪接1．利用基因融合技术表达外源基因的缘由2．基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体3．蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接基因融合的用途

上述这些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表达、表达产物的分离、纯化以及细胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。

第三节重组蛋白质的表达重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达

一、大肠杆菌中表达体系的优点大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因经常可以达到高效表达。大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌系统最大的不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。大肠杆菌体系的另一个不足之处是外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的产物。大肠杆菌表达体系的应用

当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于3～4个，以及不需要翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。1．表达载体的一般特点(1)复制起始点(2)选择性基因(3)强的、可诱导的启动子(4)强的转录终止序列(5)核糖体结合位点(6)合适的多克隆位点2．与外源基因有效表达的相关因素(1)有效的转录起始(2)有效的翻译(3)蛋白质水解作用(4)蛋白质的外泌3．改善表达水平的方法①诱导条件②外源基因的编码序列③用蛋白酶缺失的宿主菌4.改善外源蛋白溶解性的方法①外源蛋白的分泌表达②细菌生长温度③外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达④外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达有关酵母表达载体的复制、转录、筛选元件

外源mRNA在酵母细胞中的翻译

3.

外源蛋白质在酵母中的分泌表达

4.

翻译后修饰二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达

1.有关酵母表达载体的复制、转录、筛选元件

2.

外源mRNA在酵母细胞中的翻译

3.

外源蛋白质在酵母中的分泌表达4.

外源蛋白质的翻译后修饰

三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达

1．选择哺乳动物细胞表达体系的优点2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统1．哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。分泌型哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处

是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。其他表达系统原核表达系统酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统还有昆虫表达系统卵母细胞表达系统转录一翻译偶联的无细胞表达系统这些系统可根据具体需要来选择使用。

四、噬菌体显示(Phagedisplay)关于噬菌体显示的表达载体噬菌体显示技术的操作噬菌体显示技术的应用

突变蛋白质的

物理化学性质分析第一节蛋白质溶液的热力学第二节蛋白质折叠动力学

第三节突变,稳定性和折叠第一节蛋白质溶液的热力学

I.热运动与蛋白质构象

“生命的还原论”摆动,振动,转动-多肽折叠过程所涉及的主要运动形式;热力学平衡;II.热力学函数与热力学平衡III.热容量:某物质的热容量是某物质的比热与该物质质量的乘积。即Cm.单位质量的某种物质温度升高1℃吸收的热量叫做这种物质的比热容，简称：比热，用字母“c”表示。摩尔热容量的定义，即1摩尔物质温度升高（或降低）1度时所吸收（或放出）的热量，用C表示，单位是J/（molK）.比热的单位为cal/℃IV.van’tHoff焓V.折叠/退折叠转变“协同与独立”VI.量热法与折叠过程热力学第二节蛋白质折叠动理学I.折叠动理研究技术:FLOW;Stopped-flow

光化学触发;温度或压力突变;超快混合技术.II.两态动理III.过度态1)折叠过程与过度态2)对折叠过度态的性质分析第二节蛋白质折叠动理学(续1)IV.折叠的中间态1).熔球态2).快态与慢态3).二硫键引起的中间态4).多结构域蛋白的折叠第二节蛋白质折叠动理学(续2)V.折叠的基本过程1).接触形成2).螺旋-链环转变3).b发卡形成第三节突变,稳定性和折叠I.热力学参数在分子水平上的解释1).静电相互作用2).范德华相互作用3).氢键4).疏水效应5).二硫键第三节突变,稳定性和折叠(续1)II.突变与热稳定性1).疏水突变2).氢键突变3).适应极端条件的突变体第三节突变,稳定性和折叠(续2)III.突变与折叠过程1).过渡态的突变分析2).突变对稳定性和折叠过程的影响Howdoproteinsfoldintotertiarystructure?Quickly–mostsingledomainsfoldonmillisecondtimescalesHighlycooperative–specificfoldingintermediatesarerarelyobservedTraditionalview:I˚II˚III˚IV˚describesorderofstructureformationModernview:localnucleationofII˚structureelementscombinedwithcondensationor‘collapse’ofhydrophobicgroupsAlternativeperspectives-specificfoldingpathwaysvs.energylandscapesthat‘flow’downhillfrominitialunfoldedtofinalnativestructureCotranslationally?modularproteins(commonineukaryotes,notinprokaryotes)mayrequirethis(butproteinsynthinbacteriais~10xfasterthanineukaryotes-sothismaydefineextentofcotranslationalfolding)Whataredrivingforces?Entropicorenthalpic?ForcesthatstabilizenativestructurearenotnecessarilythosedrivingtheformationofthestructureInaqueous(polar)environment,H-bondtoH2OisequivalenttoH-bondbetweentwocomponentsofpolypeptidechain:H2O--H-N<vs>C=O--H-N<Thus,nostabilizationfromII˚structureformationH-bondingButinburiedhydrophobic(apolar)environment,H-bondmaybemoreenthalpicallyfavoredStudyingproteinfoldingprocessisdifficult-mixtures,notsinglemolecules;fewmeasurementscanworkatrequiredtimescales;useperturbationstodisruptnativestructure(T,pH,denaturant,pressure),monitorrefoldingkineticsSomeproteinsmisfoldiftheydon’thavehelp-chaperonesProteinfolding/unfoldingAnfinsenshowedthatproteins(RNase)spontaneouslyrefoldtothesameuniquethree-dimensionalstructure,therefore,aminoacidsequencealoneencodestertiarystructure(Nobelprize,1972)C.B.Anfinsen,Science(1973)181,223-239.NativeconfigurationsoffoldedproteinsaremarginallystableLargestabilizinganddestabilizingfactorsarebalanced,resultinginfoldedstatethatcanbeeasilydisruptedbyelevatedtemperature,pressureorchemicaldenaturantsProteinfoldi