食品质量安全检验人员微生物培训班基础

第六期全省质监系统食品质量安全检验人员（微生物）培训班

食品微生物实验基础知识南京市产品质量监督检验院

国家农副产品质量监督检验中心

刘新梅

2023/12/101●食品微生物实验室的基本要求

●微生物检验人员的工作规范

●微生物检验的基础知识2023/12/102一、食品微生物实验室的基本要求GB4789.1—2010食品安全国家标准食品微生物学检验总则NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Generalguidelines

3.1环境3.2人员3.3设备3.4检验用品3.5培养基、试剂及菌种2023/12/1033.1环境3.1.1实验室环境不应影响检验结果的准确性。3.1.2实验室的工作区域应与办公室区域明显分开。3.1.3实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要，实验室布局应采用单方向工作流程，避免交叉污染。3.1.4实验室内环境的温度、湿度、照度、噪声和洁净度等应符合工作要求。3.1.5一般样品检验应在洁净区域[包括超净工作台或洁净实验室]进行，洁净区域应有明显的标示。

3.1.6病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室（Biosafetylevel2,BSL-2）进行。2023/12/104实验室的分类、分级及适用范围实验室分级根据所操作的生物因子的危害程度和采取的防护措施，将生物安全防护水平分为四级。各级实验室的生物防护水平依次为：一级最低，四级最高。2023/12/105生物安全防护水平（BSL）一级生物安全防护水平（BSL－1）二级生物安全防护水平（BSL－2）三级生物安全防护水平（BSL－3）四级生物安全防护水平（BSL－4）2023/12/106实验室的分类、分级及适用范围实验室各级定义及适用范围一级生物安全防护实验室

实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等。2023/12/107一级生物安全防护实验室

BSL－1：

不需要特殊的防护屏障、除需要洗手池外，依靠标准的微生物操作即可获得基本的防护水平。2023/12/108一级生物安全防护实验室2023/12/109实验室的分类、分级及适用范围实验室各级定义及适用范围二级生物安全防护实验室

实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。如临床检验实验室等。

普通微生物实验室加上使用生物安全柜。2023/12/1010BSL－2：安全设备(一级屏障)

在BSL-1设施基础上增加:生物安全柜（BSC，二级）：在涉及下例情况，从事感染性生物因子工作时应该使用气溶胶和飞溅大容量培养高浓度2023/12/1011BSL－2：安全设备(一级屏障)在BSL-1设施的基础上，增加:高压灭菌锅眼睛清洗站2023/12/1012二级生物安全防护实验室典型的二级生物安全水平实验室（图片由CUH2A，Princeton，NJ，USA提供）。在生物安全柜中进行可能发生气溶胶的操作程序。门保持关闭并贴上适当的危险标志。潜在被污染的废弃物同普通废弃物隔开。2023/12/1013二级生物安全防护实验室基本生物安全设备

1、移液辅助器——避免用口吸的方式移液。有不同设计的多种产品可供使用。

2、生物安全柜，在以下情况使用：—— 处理感染性物质；如果使用密封的安全离心杯，并在生物安全柜内装样、取样，则这类材料可在开放实验室离心—— 空气传播感染的危险增大时—— 进行极有可能产生气溶胶的操作时（包括离心、研磨、混匀、剧烈摇动、超声破碎、打开内部压力和周围环境压力不同的盛放有感染性物质的容器、动物鼻腔接种以及从动物或卵胚采集感染性组织）。

3、一次性塑料接种环，也可在生物安全柜内使用电加热接种环，以减少生成气溶胶。

4、螺口盖试管及瓶子。

5、用于清除感染性材料污染的高压灭菌器或其他适当工具。

6、一次性塑料移液管，尽量避免使用玻璃制品。

7、在投入使用前，像高压灭菌器和生物安全柜等设备必须用正确方法进行验收。应参照生产商的说明书定期检测。2023/12/1014实验室的分类、分级及适用范围实验室各级定义及适用范围三级生物安全防护实验室

实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗。

2023/12/1015BSL－3：安全设备(一级屏障)在BSL-1and2安全设备的基础上，加:

感染性材料的操作在II级或III级生物安全柜

呼吸道保护在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流2023/12/1016三级生物安全防护实验室

典型的三级生物安全水平实验室。实验室与公共通道分开并通过缓冲间（双门入口或二级生物安全水平的基础实验室）或气锁室进入。处理废弃物前，在实验室内先进行高压灭菌以清除污染。应有非手控的水槽。形成向内气流而且涉及感染性材料的全部工作应在生物安全柜中进行。在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流2023/12/1017实验室的分类、分级及适用范围实验室各级定义及适用范围四级生物安全防护实验室

实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。与上述情况类似的不明微生物，也必须在四级生物安全防护实验室中进行。待有充分数据后再决定此种微生物或毒素应在四级还是在较低级别的实验室中处理。2023/12/1018最高防护实验室——四级生物安全防护实验室实验室操作：在三级生物安全防护水平上增加气锁入口、出口淋浴、污染物安全设施：Ⅲ级BSC或Ⅱ级BSC并穿着正压服、双开门高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气2023/12/10193.2人员3.2.1检验人员应具有相应的教育、微生物专业培训经历，具备相应的资质，能够理解并正确实施检验。3.2.2检验人员应掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识。

3.2.3检验人员应在检验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为污染样品。3.2.4检验人员应在检验过程中遵守相关预防措施的规定，保证自身安全。3.2.5有颜色视觉障碍的人员不能执行涉及到辨色的实验。一、食品微生物实验室的基本要求2023/12/10203.3设备3.3.1实验设备应满足检验工作的需要。

3.3.2实验设备应放置于适宜的环境条件下，便于维护、清洁、消毒与校准，并保持整洁与良好的工作状态。3.3.3实验设备应定期进行检查、检定（加贴标识）、维护和保养，以确保工作性能和操作安全。3.3.4实验设备应有日常性监控记录和使用记录。一、食品微生物实验室的基本要求2023/12/1021微生物检测设施、设备一览超净工作台或生物洁净室微生物培养箱（36℃±1℃等

）天平：（感量0.1g，0.01g）电热干燥箱（干热灭菌）高压灭菌锅（湿热灭菌）生物安全柜（最重要的安全设备，形成最主要的防护屏障）显微镜水浴锅、冰箱、冰柜2023/12/10223.4检验用品3.4.1常规检验用品主要有接种环（针）、酒精灯、镊子、剪刀、药匙、消毒棉球、硅胶（棉）塞、微量移液器、吸管、吸球、试管、平皿、微孔板、广口瓶、量筒、玻棒及L形玻棒等。

3.4.2检验用品在使用前应保持清洁和/或无菌。常用的灭菌方法包括湿热法、干热法、化学法等。3.4.3需要灭菌的检验用品应放置在特定容器内或用合适的材料（如专用包装纸、铝箔纸等）包裹或加塞，应保证灭菌效果。3.4.4可选择适用于微生物检验的一次性用品来替代反复使用的物品与材料（如培养皿、吸管、吸头、试管、接种环等）。3.4.5检验用品的储存环境应保持干燥和清洁,已灭菌与未灭菌的用品应分开存放并明确标识。3.4.6灭菌检验用品应记录灭菌/消毒的温度与持续时间。2023/12/10233.5培养基和试剂3.5.1培养基培养基的制备和质量控制按照GB/T4789.28的规定执行。3.5.2试剂检验试剂的质量及配制应适用于相关检验。对检验结果有重要影响的关键试剂应进行适用性验证。3.6菌株3.6.1应使用微生物菌种保藏专门机构或同行认可机构保存的、可溯源的标准或参考菌株。3.6.2应对从食品、环境或人体分离、纯化、鉴定的，未在微生物菌种保藏专门机构登记注册的原始分离菌株（野生菌株）进行系统、完整的菌株信息记录，包括分离时间、来源，表型及分子鉴定的主要特征等。3.6.3实验室应保存能满足实验需要的标准或参考菌株，在购入和传代保藏过程中，应进行验证试验，并进行文件化管理。2023/12/1024微生物检验人员的工作规范■

无菌操作■生物安全2023/12/1025无菌操作（彻底灭菌、防止污染）无菌及无菌操作的概念：无菌是指在环境中一切有生命活动的微生物的营养细胞及其芽孢或孢子都不存在的状态。无菌操作是指在无菌环境下进行的细胞传代培养、植物组织培养、细菌接种等操作,目的是防止微生物进入人体组织或其他无菌范围。泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。●无菌环境（无菌室、超净工作台）●无菌材料（培养基和试剂、器皿、用具的灭菌）●防止污染，保持无菌状态2023/12/1026无菌室

ⅰ、无菌室应完全封闭，进出无菌室至少要经两道门，中间隔有缓冲间，无菌室与外间设置一个可开闭的窗口，用于传递器具。

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ⅱ、无菌室必须保持整洁。工作人员进入无菌室应换专用鞋、专用衣。无菌室使用前须用紫外线消毒30min，操作结束后清洁台面，再用紫外线消毒30min。定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。2023/12/1028

ⅲ、无菌室仅用于培养基分装等无菌操作，不能进行有菌标本的操作。操作人员操作时应严格关门，并戴好专用的手套、口罩、帽子、防护服等个人防护装备

ⅳ、无菌室内应有空气过滤装置，并安装空调。2023/12/1029微生物检验人员的工作规范无菌操作要求食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，微生物实验的许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因是防止试验操作中人为污染样品。1．接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2．进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。3．接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。4．进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。5．从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。6．接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。7．接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。8．吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。2023/12/1030微生物检验人员的工作规范9无菌间使用要求1）无菌间内应保持清洁，工作后用消毒液擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。2)无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过传递窗传递。定期对无菌间进行沉降菌的监测和记录。2023/12/1031检查无菌操作是否规范的直接方法------空白对照根据GB4789.2菌落总数测定，将营养琼脂培养基倾入加有1ml灭菌生理盐水灭菌培养皿内作空白对照。空白对照的结果至少可以说明三个问题：（1）实验所使用的材料灭菌是否彻底，储存是否合理得当。（2）无菌室的空气条件是否达到要求。（3）操作人员的无菌操作技术是否规范。由此可见，通过空白对照可直接检验实验器皿、实验条件以及实验人员是否符合无菌操作的规定。如果从空白对照中看出无菌操作不规范，通过实验进一步找出原因所在，最终达到规范的无菌操作。2023/12/1032微生物检验人员的工作规范生物安全什么是生物危害？从广义上：指有害或有潜在危害的生物因子对人、环境、生态和社会造成的危害或潜在危害。而狭义上：指在微生物和生物医学实验室研究过程中对工作人员造成的危害和对环境造成的污染。2023/12/1033生物安全GB19489-2004标准的内涵:

对实验室生物安全的通用要求，以保障工作人员充分避免所操作生物因子的危害，保证危险生物因子不向实验室外扩散。“生物安全知识、防护技术的加强和安全设备的使用，对于防止大多数实验室感染的发生是非常有效的”。

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微生物检验人员生物安全工作行为

1、实验室内禁止饮食、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物；以移液器吸取液体，禁止口吸；非特殊情况，禁止使用针、注射器及其他利器，尽可能使用塑料器材代替玻璃器材，禁止用手处理破碎的玻璃器具。2、在实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内，不得穿着外出。用过的工作服应先消毒后再洗涤。3、当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套，必要时宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。4、可能产生致病微生物气溶胶或出现溅出的操作以及处理高浓度或大容量感染性从材料均应在生物安全柜中进行，并使用个体防护设备。5、接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后离开实验室要洗手。6、所有样本、培养物和废弃物应被假定含有传染性生物因子应以安全方式处理和处置，如高压灭活。需运出实验室灭活的物品必须放在专用密闭容器内。2023/12/1035

微生物检验人员生物安全工作行为

1、实验室内禁止饮食、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物；以移液器吸取液体，禁止口吸；非特殊情况，禁止使用针、注射器及其他利器，尽可能使用塑料器材代替玻璃器材，禁止用手处理破碎的玻璃器具。2、在实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内，不得穿着外出。用过的工作服应先消毒后再洗涤。3、当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套，必要时宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。4、可能产生致病微生物气溶胶或出现溅出的操作以及处理高浓度或大容量感染性从材料均应在生物安全柜中进行，并使用个体防护设备。5、接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后离开实验室要洗手。6、所有样本、培养物和废弃物应被假定含有传染性生物因子应以安全方式处理和处置，如高压灭活。需运出实验室灭活的物品必须放在专用密闭容器内。2023/12/1036

微生物检验的基础知识

一、培养基的配制与灭菌二、微生物的显微镜检查2023/12/10371、教学要求

1.1了解培养基的分类

1.2了解并掌握培养基的配制、分装方法

1.3掌握各种实验室灭菌方法及技术

培养基的配制与灭菌

2023/12/10382、原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

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琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。普通琼脂培养基

2023/12/10403、分类

3.1按照培养基的成分分为：

(1)合成培养基：合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。

(2)天然培养基：由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。

(3)半合成培养基：在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。2023/12/10413.2按照培养基的物理状态分为：

(1)固体培养基：是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。

(2)液体培养基：体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。

(3)半固体培养基：在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。

2023/12/10423.3按照微生物的种类分为：

细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基；常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基；常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基和察氏培养基等。2023/12/1043微小毛霉菌落沙堡弱培养基酵母菌在孟加拉红培养基上

2023/12/10443.4按照培养基用途分为：

(1)加富培养基：是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。

(2)选择性培养基：是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

(3)鉴别培养基：是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。2023/12/10454操作流程和步骤1)称量及溶化2)调pH

3)加琼脂、溶化、定容、（过滤）4)分装、加塞、包扎5)灭菌（高压蒸汽灭菌法）2023/12/10465.1培养基的制备

1、称量药品:根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2、溶解：用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。

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3

、调节pH

根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HCl溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。

4

、溶化琼脂

固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

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5、过滤分装

先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。

2023/12/1049培养基的分装（图中是利用培养基分装泵进行分装）2023/12/1050

6、包扎标记

培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。

7、灭菌

上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。

8、倒平板

将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板2023/12/1051

5.2

灭菌方法和步骤

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本次课主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为：(1)在湿热条件下，细菌吸收水分，使菌体蛋白质易于凝固变性。(2)温热蒸气的穿透力比干热空气强，能较快提高灭菌物品内部的温度。(3)热蒸气与物品接触，由气态变为液态时可放出大量潜热，能迅速提高灭菌物品的温度。2023/12/10521湿热灭菌

1、煮沸消毒法

注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15～30min，对于芽孢则需煮沸约1～2h。

2、高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。2023/12/1053

3、操作方法和注意事项如下

（1）加水

打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。

（2）装料、加盖

灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。2023/12/1054

（3）

排气

打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净（4）

升压、保压和降压

当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。

2023/12/1055（5）灭菌后的培养基空白培养

灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。

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2、干热灭菌法

通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。

干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。2023/12/1057

3、火焰灭菌

直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。

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6、注意事项

1、要严格按配方配制。

2、培养基分装过程中注意不要使培养基沾管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。

3、使用灭菌锅应严格按照操作程序进行。灭菌所需时间到后，要先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，才能打开排气阀。

4、每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源和各种成分的牌号最终pH值、消毒的温度和时间、制备的日期和制备者等，记录应复制一份原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放，以防发生混乱。2023/12/1059

二、微生物的显微镜检查微生物个体微小，其形态结构用肉眼直接观察不到，要利用显微镜。显微镜有不同类型，如普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜等，其应用目的是不同的，实验室可根据观测项目不同选择相应的类型。2023/12/1060

由于微生物细胞含有大量水分（一般在80%～90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。2023/12/1061

染色Ⅰ、染色的基本原理

微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化学反应。细菌的等电点较低，PH值大约在2～5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带正电。

所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。2023/12/1062

影响染色的其他因素还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养基的组成、菌龄、染色液中的电介质含量和PH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色。2023/12/1063Ⅱ、染色方法

微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序，即：

制片、固定、媒染、染色、脱色、复染、水洗、干燥、镜检2023/12/1064

微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽孢、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。2023/12/1065ⅰ、单染色法

用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。2023/12/1066染色结果依染料不同而不同：石碳酸复红染色液：着色快，时间短，菌体呈红色美兰染色液：着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色

草酸铵结晶紫染色液：染色迅速，着色深，菌体呈紫色2023/12/1067

ⅱ、革兰染色法

革兰染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，