GBT 4789-13产气荚膜梭状芽孢杆菌检验2

第五章致病性的芽孢杆菌检验第一节肉毒梭菌及肉毒毒素检验第二节蜡样芽孢杆菌检验第三节产气荚膜梭菌检验

食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验Microbiologicalexamination:

Clostridiumperfringens

GBT4789.13-2012

Clostridiumperfringensx10,000

/cmspweb/datav1/im080014.htm

本节主要内容：

产气荚膜梭状芽孢杆菌的生物学特性和检验程序及对检验程序的解释。

目录1、概述2、生物学特性（菌体形态学特征、培养特性和抵抗力）3、毒素与分型4、培养基和试剂5、检验程序6、说明/.../09/uuoeoeoeuoeuuu.html

1、概述

产气荚膜梭状芽孢杆菌(C.perfringens)又称魏/卫氏梭菌分布：自然界广泛存在。易污染食品：动物性食品原料产气荚膜梭菌为厌氧芽孢菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一，可引起典型的食品中毒，临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标是检验食品被该菌污染的程度，其重点项目是活菌数测定及确证试验。2、生物学特性1)形态与染色

G+无鞭毛可形成荚膜和芽胞的大杆菌大小：为(1－2)μm

×(2－10)μm。芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的直径，有的菌株难形成芽胞。荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基内生长时可形成荚膜。Clostridiumperfringens/research/micimm/index.php

www.uni-ulm.de/.../Diagnostik/Erreger/c_keim.htm2)培养特性*不严格的厌氧*普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。

*适宜生长温度为37—47℃。*生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。*在45℃高温下可进行快速分离纯培养，每培养3—4h传种1次，较易分离纯化。深层葡萄糖琼脂培养：－－大量产气，致使琼脂破碎；牛奶培养基中生长：－－45℃下2h可见到激烈发酵：庖肉培养基中培养：－－产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化。普通琼脂平板上培养：－－15h－24h形成S型菌落，在营养不足或琼脂浓度高的平板上可形成R型菌落。/course/fsc/441/resulex10.htmlat45C，ClostridiumperfringensisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation

。鲜血琼脂平板生长：

－－菌落周围出现双层溶血环，内层溶血完全，外层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带灰黄色至浅灰褐色，与空气接触30min后，有时可能逐渐变为灰绿色、甚至鲜绿色，这是本菌的特征之一。

ClostridiumperfringensbacteriaonabloodagarplateCourtesyGlennSonger,The

University.ofArizonaCollegeofAgricultureandLifeSciences.

：/articles/01_02/Clos...Clostridiumperfringensshowsdouble-zonehemolysisonbloodagar.Notethesmallareaofbetahemolysis(completelysisofredbloodcells)surroundedbyalargerzoneofalphahemolysis(partialhemolysis).Theplateissittingonablacklabbenchwww.cat.cc.md.us/.../labmanua/lab16/bloodcp.htmlClostridiumperfringensGrowingonBloodAgar/articles/01_02/Clos...www.cat.cc.md.us/.../labmanua/lab16/bloodcp.html

菌落周围出现乳光浑浊带，此反应能被本菌的α抗毒素抑制。

*由于发酵乳糖，菌落周围的培养基颜色发生变化

*本菌不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周围不出现透明环及虹彩层（肉毒梭菌可形成）。www.sat.affrc.go.jp/.../Cl_perfringens.htm乳糖牛奶卵黄琼脂平板上培养3)生化特性

*发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，*液化明胶*还原硝酸盐为亚硝酸盐。*能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落*发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓‘‘暴风雨式发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。/aaa/micro.html3、毒素与分型

毒素：产气荚膜梭菌能产生外毒素和肠毒素。

外毒素：致死毒素、坏死毒素和溶血毒素，毒性不强不耐热。还有透明质酸酶等酶类。肠毒素：不耐热，60℃经10min即可破坏不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。

分型：

根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成A，B，C，D，E和F六个型。

A型：最常见，引起气性坏疽和食物中毒；A型最早由WelchandNuttal(1892)分离，所以叫卫氏/魏氏梭菌

C型：可引起肠炎。

*对人致病的主要是A、C和F型

*引起食物中毒的主要是A型

抵抗力

产气荚膜梭菌有时很不容易形成芽孢。芽孢的热抵抗力很强，由患者粪便中分离的芽孢能耐受100℃1-5小时加热。A型与C型菌株的芽胞：耐热性强，煮沸1－3h，繁殖型菌体不耐热。www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html食品加热后未及时冷却，所含耐高温而残余的产气荚膜梭菌芽孢会迅速发芽，大量繁殖，菌数可达数十万/g，食用前又未加热，则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。4、培养基和试剂4.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC）

--能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及

铁盐(含有柠檬酸铁胺)的琼脂中形成黑色菌落，TSC分离培养和计数用

（TSC）4.3液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）

－－大量培养该菌用4.4缓冲动力—硝酸盐培养基

--无鞭毛，不运动；还原硝酸盐为亚硝酸盐4.5含铁牛奶培养基

/course/fsc/441/resulex10.html--发酵牛奶中的乳糖，产酸，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓‘‘暴风雨式发酵”/“暴烈发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。观察2h，5h不发酵为阴性4.6乳糖-明胶培养基4.70.1％蛋白胨水稀释剂；4.8硝酸盐还原试剂:甲萘胺液和对氨基苯磺酸液：在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与α－萘胺偶合形成紫红色。4.9革兰氏染色液。5.0缓冲甘油-氯化钠溶液镜检形态检样25g（ml）样品＋225mL0.1%蛋白胨水任选黑色菌落5个，分别接种FTG培养基

厌氧培养，361℃，20h~24h，黑色菌落计数乳糖-明胶报告均质、稀释10-1~10-6稀释液各1mL+TSC琼脂混合确证试验

牛奶发酵动力-硝酸盐5.检验程序

胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂液体硫乙醇酸盐(FTG)46℃,2～5h爆发酵36℃,24h＋36℃,24h＋6、操作步骤

（1）样品制备样品采集后尽快检验，若不能及时检验，可在2℃-5℃保存，若8h内不能进行检验，应以无菌操作称取25g(ml)样品加入定量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快置于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。以无菌操作称取25g(ml)样品放入含有225ml0.1％蛋白胨水的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1-2min，或置于盛有225ml0.1％蛋白胨水的均质杯中，8000-10000r/min均质1-2min，作为1：10稀释液。以上述1：10稀释液按1ml加0.1%蛋白胨水9ml制备10-2-10-6的系列稀释液。6、操作步骤

（2）培养：取稀释至10-1－10-6倍，取1ml放入2个平板，分别加15mlTSC琼脂；待上述琼脂凝固后，再加10ml冷却至50℃的TSC琼脂均匀覆盖平板表层；待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，于36℃培养24h，典型的菌落为黑色菌落数。TSC琼脂凝固后，增加了"用10mLTSC琼脂覆盖平板表层"，并将"倒置培养"改为"正置培养"。这样修改后更有利于产气荚膜梭菌的生长，同时有助于获得黑色菌落的典型形态，还可有效防止菌落蔓延生长。/course/fsc/441/resulex10.html（3）确证试验

纯培养：由平板上任取5个黑色菌落，分别接种FTG培养基，于(36±1)℃培养18－24h。

菌体形态和染色检验：用培养液涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于菌体中央或近端。

牛乳发酵试验：

取生长旺盛的FTG培养液1ml接种于含铁牛乳培养基，在46℃水浴中培养每小时观察有无“暴烈发酵”现象。5h内不发酵者为阴性。－－产气荚膜梭菌发酵乳糖，产酸凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴风雨式发酵”现象，但培养基不变黑色。

检查动力和硝酸盐还原实验：－、＋

用接种环(针)穿刺接种动力-硝酸盐培养基，于(36±1)℃培养24h.--判断有无动力--产气荚膜梭菌无动力；

--滴加硝酸盐还原试剂“甲萘胺液和对氨基苯磺酸液”各0.5ml，观察硝酸盐是否被还原,产气荚膜梭菌，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。＋在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与α-萘胺偶合形成紫红色染料。

(5)乳糖－明胶试验＋＋

取FTG培养基穿刺接种乳糖－明胶培养基，于(36±1)℃培养24h，观察结果。将试管于5℃左右放置1h，检查明胶液化情况。如果培养基是固体，于(36±1)℃培养24h，重复检查明胶是否液化。产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。3、菌数计算选取典型菌落数在20CFU-200CFU之间的平板，计数典型菌落数。/course/fsc/441/resulex10.html报告：按照上述公式计算，报告每g(ml)样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/g(ml)表示，如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍时报告。

Clostridium

perfringens

复习题1、食品中产气荚膜梭菌检验的主