微小亚历山大藻产毒特性研究

微小亚历山大藻产毒特性研究

从20世纪开始，赤潮在世界范围内频繁发生，直接或间接地影响着渔业、沿海旅游业和食品安全，损害了海洋生态系统。赤潮毒素中麻痹性贝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)是已知对人类生命健康构成威胁的海洋藻毒素中影响最大、分布最广泛、危害最大的一种。亚历山大藻作为PSP重要产毒藻,与大多数麻痹性中毒事件密切相关。随着近年我国沿海经济的发展,近海水体污染日趋严重,亚历山大藻在近岸水体和底泥中经常出现。微小亚历山大藻是我国沿海有毒甲藻中PSP的主要产毒藻之一,其生长和毒性受到各种环境因子的影响,其中N、P营养盐的影响最为显著。N、P营养盐对亚历山大藻产毒影响的早期研究,集中在对营养盐的浓度及种类做一定调整,改变藻的培养因子,进行一代培养及检测产毒情况。实际海水中的N、P营养盐浓度和比例是动态变化的,而微小亚历山大藻对N营养盐和P营养盐的利用状况相关并相互作用。到目前为止,还很少见有关微小亚历山大藻在N多P少或P多N少的情况下,即N、P比例失调条件下,产毒能力随世代增加的变化规律。本文通过调整N、P比例,研究了当一种营养盐成为制约因素时,其对亚历山大藻产毒做何影响。改变藻的培养条件并且连续进行了三个世代的培养,研究长期N、P比例失调的培养条件,对微小亚历山大藻产毒能力的影响随藻世代增加的累积效果。并且动态跟踪了每个世代前后,培养基中N、P浓度的变化,分析产毒藻对N、P营养盐的吸收情况,将不同比例下藻对N、P吸收量的变化与藻细胞产毒能力做了对照分析。1材料和方法1.1陈海水来源及其分布实验用微小亚历山大藻(Alexandriumminutum),由近海海洋环境科学国家重点实验室海洋微型生物保种中心(CCMBP)提供,培养基为f/2的改良配方,其中陈海水来源为东海自然海水,由国家海洋局东海监测中心提供,pH值为8.1±0.1,盐度为25±1。培养温度为21℃,光周期L∶D=12h∶12h。用于毒素分析的4种PSP标准样品(GTX14,GTX23,C12,STX)均网购自加拿大海洋生物研究所(NationalResearchCouncilofCanada,NRCC)。1.2实验方法1.2.1n、p营养盐比例以f/2培养基中N、P营养盐比例为基准进行调整,设定1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10;1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1,20个不同比例N、P营养盐比例(其中NO3-N的单位浓度为54.7mg/L、总磷(TP)的单位浓度为3.42mg/L,氮源:NaNO3,磷源:NaH2PO4·H2O)对微小亚历山大藻培养。为研究不同N、P浓度比例培养的累计效应,进行了20个N、P比例进行了连续三个世代的培养,培养周期为25d,每3d取一次样计数,采用鲁哥氏液固定后显微镜平板计数法,每次取样设三个重复,进行生长曲线的绘制,并在细胞浓度最大时,对藻液产毒情况进行定性定量分析。1.2.2提取并分离纯度国外的毒素(1)pvc萃取产物mL新鲜藻液,经探针式超声破碎5min,镜检确定细胞壁已破碎,离心取上清液,添加5mL0.0lmol乙酸溶液,沸水浴萃取10min,离心后得上清液,为PSP粗萃取产物。(2)a型毒分离液s1取PSP粗萃取物过C18柱,所得毒素分离液主要含GTX14、STX。C18柱分离液再过阳离子交换柱纯化分离,所得毒素分离液主要含C12。再加0.3mol/LNaCl淋洗阳离子交换柱,所得洗脱液主要含GTX23。(3)ch品种、配合物的ph值,5.3moolh4的降解0.03mol/LHIO4,0.3mol/lCH3COONH4,0.3mol/LNa2HPO4,按1∶1∶1比例配成,调节pH=8.3,室温氧化15min后上机分析。1.2.3荧光分离器ro实验分析方法参考柱前衍生高效液相色谱AOAC官方分析方法,并对分析条件优化调整。仪器为岛津公司的LC-10Avp系统,采用WatersC18反相柱:319mm×150mm、柱温40℃,流速1.0mL/min。梯度洗脱方法:流动相A:0.1mol/L甲酸胺;流动相B:0.1mol/L甲酸胺5%乙腈水溶液;均用冰乙酸调整pH为5.5。走峰时间15min,洗脱梯度为:0～5minBconv.5%;5～9minBconv.70%,9～13minBconv.30%,13～15minBconv.5%。荧光检测器激发波长为340nm、发射波长为390nm。进样量为100μL、出峰时间集中在3～6min,8～10min。1.2.4两种吸收量的测定实验过程中分别测定了微小亚历山大藻三个生长周期前后的培养基中N、P浓度,从而得到微小亚历山大藻对二者吸收量的变化。主要测定了NO3-N、NO2-N、NH4-N、TP四个指标,由于投放的N营养盐都是以硝态N存在的,且均未检测到NH4-N存在,NO2-N的量比NO3-N低了3个数量级以上,因此,认定NO3-N的吸收量为微小亚历山大藻对N的吸收量。2结果与讨论2.1产毒能力分析几种PSP毒素经过SPE柱分离后,主峰出峰时间可以明显分离开来,均检测到有GTX14、GTX23、C12、STX产生,但其产毒种类和毒素组成比例无固定规律,本文主要以PSP产生总量(pg/cell)作为产毒能力的衡量指标。不同N,P比例培养的3代微小亚历山大藻产毒总量的分布情况如表1所示。2.2藻n、p的吸收曲线N,P比例变化时,随TP浓度变大,3代微小亚历山大藻P,N的吸收情况,如图1所示,随TN浓度变大,3代微小亚历山大藻N、P的吸收情况,如图2所示。以上曲线可以看出,微小亚历山大藻在P过量时,随着TP浓度的线性增加,其吸收量成比例增加,而对N的吸收量呈曲线波动,反之,在N过量时,N的吸收量亦成比例增加,而对P的吸收量呈曲线波动。可知一种营养盐浓度的线性升高,其吸收量随之成比例增长,但不能促进或抑制对另一种营养盐的吸收率。2.3生物处理对藻体产毒能力的影响20个不同N,P比例下,3代微小亚历山大藻产毒能力变化,如图3所示,并通过三代平均的产毒情况,反映微小亚历山大藻产毒能力随N、P比例调整,总体的产毒变化趋势。由三代平均藻细胞产毒能力曲线可看出,微小亚历山大藻在N、P比例变化时,仍然能正常生长产毒,三代培养具有一定重现性。随N、P比例的不同,产毒能力均呈现曲线形式波动;通过比较三代藻细胞产毒能力曲线可看出,微小亚历山大藻在N、P比为1∶4、4∶1时,产毒能力较强,随藻世代增加,产毒变化的累积效应变缓和,产毒能力整体随世代增加变弱。结合前面产毒藻对N、P吸收情况的分析,藻对过量营养盐的吸收量随浓度增加而线性增加,对不足量的营养盐的吸收量呈现曲线变化,同时其产毒情况亦为曲线变化,可推断,当N、P比例失调时,量不足的营养盐为制约性因素,直接影响藻的产毒能力。2.4营养盐对小球藻产毒能力的影响为深入探索藻细胞产毒变化与制约性营养盐吸收量的关系,下图将二者关系进行了对照,并做了相关性分析,其中对营养盐吸收量、产毒能力,均指三代平均水平,如图4和图5所示。经SPSS软件计算,得出图4两组数据的相关系数为0.145,图5相关系数为0.396。结果表明对两种制约性营养盐的吸收,同藻的产毒能力均呈现一定的正相关关系。既吸收量越多,产毒能力越强,但相关关系不明显,一定原因上由于两者数据的数量级差别较大,其变化趋势无法严格对应,同时藻的产毒受很多环境影响因子的影响,无法完全消除其他因素如细菌类微生物的干扰。具体的机理,还有待在以后的研究里,进一步探索。影响亚历山大藻生长,产毒的环境因子较复杂,本次研究主要针对营养盐方面,对微小亚历山大藻在N、P失调时产毒变化情况进行了初步探索。主要得出以下结论:(1)微小亚历山大藻在N、P失调的培养条件下,仍然能在一定时间内稳定地的生长产毒,随N、P比例的线形变化,产毒能力呈现曲线形式波动。(2)当一种营养盐过量时,投放量相对不足的营养盐成为影响产毒的制约性因素,其吸收量同细胞产