贝毒的检测方法研究进展

贝毒的检测方法研究进展

20世纪50年代以后，海洋环境问题日益严重，红潮频繁发生。赤潮中将近有20种腰鞭毛虫和少数的硅藻可以产生藻黄素,贝类生物体通过滤食有毒藻黄素,经过生物累积和放大,转化为有机毒素,这些毒素统称贝类毒素(ShellfishToxins)。贝类毒素引发的中毒症状可分为麻痹性贝毒、腹泻性贝毒、神经性贝毒、记忆缺失性贝毒、西加鱼毒及近年来在欧洲沿海国家的养殖贝类中发现的一类新贝类毒素-Azaspiracids(AZAs)。贝毒危害具有突发性和广泛性,且毒性大、反应快、无适宜解毒剂,给防治带来了许多困难,因此,开展贝毒研究对确保水产品质量安全具有重要意义。随着现代分析技术的发展,越来越多的高分辨率分析手段被应用于贝毒的检测。目前国际上的贝类毒素检测方法主要有小鼠生物分析法、免疫学法及化学仪器分析法,其中使用最多的是小鼠生物分析法,如AOACMethod959.08,GB/T5009.7212-2008与GB/T5009.213-2008。但贝类毒素的复杂性,使得常用的这些方法已难以解决贝毒检测中出现的新问题,更加完善、方便、快捷的贝类毒素检测新技术的研究已成为该领域的研究焦点。1甲藻毒素和金属酶(ParalyticShellfishPoisoningtoxins,PSP)PSP是一类四氢嘌呤的衍生物,主要由有毒甲藻产生,通过食物链在贝类等生物体内累积放大,对人体神经系统产生麻痹作用,主要分为石房蛤毒素(Saxitoxins)、新石房蛤毒素(NeoSaxtoxins)、漆沟藻毒素(Gonyautoxins)、C毒素等。PSP是通过阻断兴奋膜中的纳离子通道,造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用,是贝类毒素中分布最广、危害最大的一类。1.1采用其他生物检测家庭暴力中的毒性1937年,Sommer和Meyer首次利用小白鼠生物分析法测定PSP,该方法也被制定为AOAC的标准方法。在AOAC法中,贝类提取液通过腹膜注射入小鼠体内,根据小鼠表现的症状及死亡时间来判断提取液的毒性大小。AOAC是国际广泛使用的方法,也是我国海域PSP调查中应用的主要方法。AOAC在概括样品毒性方面相当有效,但也有较多的限制,如不能确定样品中毒素结构;毒素分子与受体亲和的错误率高(±20%),灵敏度较低;不同品种的小白鼠对PSP的敏感性不同,缺乏对比性;无法对PSP进行定量分析等等。此外,由于采用活动物实验,在伦理道德上限制了其在一些国家的应用。也有文献报道将其他生物应用于PSP的检测。McelhincyJ等人用沙漠蝗虫(schistocercagregaria)来检测PSP的毒性。于蝗虫的第2和3体节之间沿着腹部注射10μg测试样品液,记录注射后30min、60min和90min时被麻痹昆虫的百分数,计算出ED50值,从而检测出样品毒性,结果与小鼠法及高效液相色谱等方法的检测结果基本相符。1.2酶联免疫检测免疫分析技术分为血球凝聚、放射免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)等。近年来得到快速发展的酶联免疫吸附方法(ELISA方法),以其特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速和分析成本低的优点被广泛应用于环境中污染物的分析。1993年,Cembella等应用偶联到合成载体上的STX诱导产生多克隆抗体,建立了酶联免疫吸附检测技术。运用酶联免疫技术检测,贝类组织中的PSP灵敏度最低可至0.0002mgSTXeq/kg。ELISA检测方法对STX有较高的敏感性,目前一些商品化的测试盒如RIDASCREENRSaxitoxin可取得满意的结果。于兵等将酶联免疫法与小白鼠分析法进行比较,实验数据表明酶联免疫法具有检测低限低、检测成本少、样品前处理简便及阳性结果与其他方法相一致等优点。由Davio等发展起来的受体分析法也属于免疫化学法。藻毒素与其受体作用,其结合程度的高低可体现在生物活性的大小,因而测定活性的大小就可检测出毒素的情况。该法主要针对STX,用3H标记的STX与未标记的进行竞争性替换检测,方法具有快速,灵敏等特点。1.3结晶紫法检测类毒素PSP类毒素具有钠离子通道阻滞剂的特性,可拮抗箭毒苷、藜芦碱的作用,以减少或“解救”细胞形态的改变及细胞裂解死亡,且此拮抗或“解救”作用与PSP类毒素的量呈剂量反应关系。早期建立的方法是用显微镜计数活细胞数以检测PSP类毒素的量。90年代初,加拿大学者对该方法进行了改进,应用结晶紫对细胞进行染色,用酶标仪测定。该方法减少了细胞用量,检测自动化,可同时大量检测样品,灵敏准确,但需要对细胞染色,多次洗板,固定,干燥,裂解细胞,操作繁琐。近年来,美国学者对该方法进一步作了改进,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)代替结晶紫。方法操作步骤简便,操作时间短,方法易掌握,检测试剂费用低。1.4化学仪法1.4.1化剂的质谱行为液相色谱法/荧光检测法能对PSP的成分进行准确地分析和测定。由于PSP毒素分子本身生色基团很弱,不能直接用紫外或荧光检测,通常要将PSP毒素分子的环结构氧化成荧光生色团。选用的氧化剂主要为H2O2或叔丁基过氧化氢,衍生化法有柱前氧化法和柱后氧化法。欧洲标准EN14526、EN14194即分别采用柱前氧化法和柱后氧化法。柱后氧化法中毒素检出限与小白鼠分析法相比可低一个数量级,且能达到与小白鼠生物分析法结果相匹的满意结果。尽管如此,氧化条件如氧化剂、pH、温度和反应温度的轻微变化都可能改变毒素分子的荧光性能。液相色谱/质谱法由于其能提供结构方面信息也用于研究PSP。Jaime等通过使用离子交换色谱与电喷雾离子化质谱联用定量分析PSP毒素。Dell’Aversano等采用此方法一次性同步分析PSP毒素中的所有衍生物。1.4.2不同毒素分子所带负荷的差异毛细管电泳可用于测定PSP毒素中的非衍生毒素,如GTX,STX,noeSTX等,主要有毛细管电泳-紫外检测法和毛细管电泳-质谱法。在PSP家族中,各种毒素分子所带电荷量不同,如STX、neoSTX、dc-neoSTX、dc-STX等均带2个正电荷,GTX1~6、dc-GTX1~4、do-GTX2/3等均带1个正电荷,而C1~C4都不带电荷,所带电荷量的差异可用电泳技术初步分离PSP。在醋酸纤维薄膜上涂氧化剂(如H2O2等)加热氧化,使毒素分子发生颜色反应,在紫外灯下检测。串联的质谱分析技术可提供毒素分子的结构信息,以鉴定各异构复合物。1.4.3各发展阶段发展的空间薄层色谱法是检测PSP毒素的传统方法之一,目前使用已较少,但新的检测设备的出现为其发展提供了新的空间。Indrasena在Chromarods-SIII层析柱上对STX及其同系物进行棒状薄层层析分离,以火焰热离子检测器(FTID)进行检测,结果STX的检出限为5ng,其余同系物的检出限也均达到ng级。2聚醚化合物结构(DiarrheticShellfishPoisoningtoxins,DSP)DSP是几类有毒物质的总称,具体包括①聚醚化合物:大田软海绵酸(Okadaicacid,OA)和鳍藻毒素1-3(Dinophysistoxin,DTX1~3);②大环聚醚内酯物:pectenotoxin(PTX1~4)和Prorocentrolide;③聚醚融合物yssotoxin(YTX)。目前国内外研究较多的OA及其衍生物是一类多环聚醚类的脂肪酸衍生物。2.1腹泻性贝毒的提取DSP最普遍的检测方法是小鼠生物测定法,即测定小鼠急性中毒的毒量。该法是由Yasumoto等人建立的,现为许多国家和地区检测腹泻性贝毒所用。用丙酮等有机溶剂提取贝类或其他样品中的腹泻性贝毒,过分离柱,吹干浓缩,以体积分数为1%的吐温-60生理盐水溶解残留物,腹腔注射小白鼠,观察存活情况,计算毒力。我国的国家标准方法GB/T5009.212-2008采用的就是此法。该法与PSP的小鼠生物分析法相似,简便易行,适合于大规模、批量样品的检测,缺点是不能区别毒素的种类和结构,干扰大、不精确。2.2蛋白磷酸酶活力抑制分析方法在免疫分析法中,国际上见报道于DSP的方法主要为酶联免疫检测法,现已出现商用的检测DSP的ELISA试剂盒。利用OA对蛋白磷酸酶活力抑制的特性,选择一种在酶催化反应后能够产生荧光产物的物质作为底物,依据酶反应过程中产物产生的速率来指示酶活力受抑制的程度,进而计算抑制剂OA的浓度。基于这一原理建立的蛋白磷酸酶活力抑制分析方法成为一种很有发展潜力的DSP测试方法。有国内学者采用胶体金标记抗体,通过竞争免疫反应,研究软海绵酸的免疫层析测定法。但是,建立一种物质的胶体金免疫层析快速检测方法的影响因素非常多,尽管在理论上已经很成熟,可实际中成功率并不高。由于这是一个复杂的实验过程,涉及到众多的条件因素,因此必须经过大量的实验工作摸索,严格操作,以保证试验的准确性。2.3化学仪法2.3.1a、dtx毒素标记高效液相色谱技术是目前国内外普遍接受的DSP分析方法。DSP毒素含有允许被转化成荧光酯衍生物的羧基,因此可用液相色谱-荧光法进行分析。最早由Lee等于1987年建立起来,以ADAM(9-anthryldiazomehtane)为荧光衍生试剂对OA和DTX毒素进行标记,以酸化的乙氰/水溶液作为流动相,在Cl8反相柱上进行分离。我国在1998年首次建立了OA的HPLC检测方法,并应用到贝类样品检测中,最低检测浓度达0.1μg/100g。但由于ADAM不稳定,限制了该方法的广泛应用。不同的荧光衍生试剂和衍生前纯化方法也被研究应用于DSP仪器分析技术的改进。高效液相色谱法分离度好、灵敏度高,但前处理步骤复杂,荧光衍生时间长,衍生背景易受干扰,试剂成本高。液相色谱质谱联用技术具有准确、灵敏度高的优点,可鉴定腹泻性贝毒不同结构的微小差异,成为DSP液相色谱分析法的重要补充,被应用于DSP分析。方晓明等采用高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱(LC/Q-TOFMS)联用技术对贝类样品的腹泻性贝毒大田软海绵酸(OA)进行了检测研究,方法检出限仅为5~40ng/g。2.3.2氨基酸衍生物活性气相色谱法可用于分离和测定OA系列的毒素。分析时首先用乙醚萃取,再用硅胶渗透色谱和反相分配色谱分离和纯化,用氢焰检测器分析毒素的三甲硅油衍生物。蛋白质磷酸酶抑制试验是利用DSP可抑制丝氨酸、苏氨酸类蛋白质磷酸酶PP1和PP2A的活性。初期的实验以硝基苯磷酸盐(p2NPP)为底物,比色法检测,但假阳性高。改进后,方法以磷酸甲基馓酮或二磷酸荧光素为底物,荧光法检测,具有准确、快速、灵敏(1μg/100g)、样品处理简单等优点。3小鼠海马酸藻盐的毒素—记忆缺损性贝毒(AmnescicShellfishPoisoningtoxins,ASP)ASP的主要毒素成分为软骨酸藻(Domoicacid,DA),它是一种强烈的神经毒性非蛋白氨基酸,由长链羽状硅藻代谢产生的一种物质,能导致短期记忆功能长久损害,因此这类毒素被称为记忆缺损性贝毒。3.1生长效率检测1987年该方法首次应用于加拿大贝毒事件中分离出的微量DA的测定,结果显示该方法对贝类组织中高浓度毒素成分的检测十分成功。但该方法不适用于作用水平在20μg/g以下的组织情况。ASP对小鼠有独特的搔抓症状反应,该症状可在贝类组织中DA含量超过40μg/g时观察到,并且在其含量超过100μg/g时更加明显。3.2软骨藻酸毒素的检测新西兰曾开发过一种多克隆抗体ELISA法以检测ASP,灵敏度为3.8ng/100g。Kleivdal等发现直接用EL1SA法检测软骨藻酸毒素的校正曲线范围为10~260pg·mL-1,其动力学检测范围为0.01~250mg·kg-1,而液相色谱法检测水平为0~244mg·kg-1。许艳道等通过将DA偶联到蛋白载体上,免疫BALB/c小鼠,免疫数次后,得到抗DA的多克隆抗血清。以DA-OVA为包被抗原,利用抗原抗体反应,建立间接竞争酶联免疫吸附技术分析检测海水样品和海洋贝类中的赤潮毒素失去记忆性贝毒DA的方法。3.3高效液相萃取法现在应用广泛、方法完善的高效液相色谱(HPLC)-紫外检测方法和HPLC-MS分析方法因其选择性和灵敏度高而被普遍认可。但样品的前处理操作复杂,故而不易满足大批量样品的检测分析需要。Hummert等提出的柱切换系统可以有效的降低干扰的影响,可直接分析粗提的样品,省去了复杂的样品预处理过程。毛细管电泳法是海洋生物毒素分离检测技术之一。李大志等采用CE法,以甲醇-水作为提取液,结合阴离子交换柱和阳离子交换柱的净化,避免了基体中色氨酸的干扰,对CE检测条件进行优化,方法检出限为0.063mg/L,并利用优化后的方法对5种经济贝类样品进行了测定。吴映璇等用甲醇-水提取,提取液经LC-SAX强阴离子柱固相萃取(SPE)净化,供快速高分离液相色谱仪测定,外标法定量。方法简便、快速、准确,测定低限为10mg/kg,可用于贝类中记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸残留量的检测。4短裸甲藻毒素检测(NeurotoxicShellfishPoisoningtoxins,NSP)神经性贝毒的活性物质主要为BrevetoxinA(BTX-A)、BrevetoxinB(BTX-B)和HemibrevetoxinB(HeBTX-B)。这类毒素是由短凯伦藻Kareniabrevis(syn.Ptychodiscusbreve:Gymnodinidiumbreve)产生的。由于产毒藻短凯伦藻也曾称为Ptychodiscusbreve,因此这些毒素也称为Ptychodiscusbrevetoxin(PbTx)。NSP测定方法的文献报道不多,主要采用小白鼠生物分析法,但它的灵敏度和特异性有限。其次就是色谱分析法,NSP色谱分析包括薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC法主要用于毒素的分离和纯化。HPLC法由于共流出物背景干扰,采用紫外检测在灵敏度和选择性方面存在问题,而采用质谱(MS)检测,可提高选择性和灵敏度。方晓明等采用高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱(HPLC/Q-TOFMS)联用技术对贝类样品中的短裸甲藻毒素PbTx-2进行了检测研究。HPLC/Q-TOFMS具有高灵敏度、高选择性的特点,可以在极低的浓度下作全谱扫描、提供精确质量,对微量神经性贝毒PbTx-2进行快速鉴别和测定,其检测限达到0.5ng,回收率及精密度都可得到满意结果。目前免疫测试技术也已应用于NSP的检测。Maucher等用直接EL1SA法和最优血液收集卡法检测瓶鼻海豚沾染短裸甲藻毒素PbTx-3,这种方法后来被用于监测红潮发生区海豚、海龟以及海牛中的短裸甲藻毒素。但免疫技术抗体往往只是针对某一种毒素所建立,因而对于其他贝毒常常表现出较低的交叉反应,不能检测所有的贝毒。这对于某一种毒素来说,可能产生假阳性或者过高的估计值,但由于抗体与不同毒素间亲合力的明显差异使得对于总的毒性的评价则可能得到较低的估计值。5其他贝类毒素5.1cfp-mtx法(CiguaterraFishPoisoningtoxins,CFP)西加鱼毒(CFP)是在海洋珊瑚礁系统中积累的一种毒素,主要的产毒藻是有毒岗比亚藻(Gambierdiscustoxicus),可分为脂溶性的西加毒素(Ciguatoxins)和黑儿茶(Gambiero1),水溶性的刺尾鱼毒素(Maitotoxin,MTX)和水媳毒素(Palytoxin)2大类。CFP中毒的主要表现是神经功能失调,特征是被称为“干冰的感觉”的热感颠倒,CFP虽然死亡率较低,但每年中毒者却高达数万人,而且容易诱发其他疾病。小鼠生物法被广泛用于西加鱼毒素的检测,采用二乙醚抽提西加鱼毒素,1%吐温-60/0.9%生理盐水溶解后进行小鼠注射。除小鼠外,鸡、卤虫、蚊子等也被用于西加鱼毒素的检测。放射免疫技术、酶联免疫技术也被用于西加鱼毒素的检测,但是西加鱼毒素的抗体和其他聚醚类物质的交叉反应以及抗体供应限制了免疫学方法的广泛应用。西加鱼毒素本身不具有可用于色谱检测的发色团,但是通过对其羟基进行标记,可实现西加鱼毒素的液相色谱分析。西加鱼毒素的HPLC方法是利用毒素分子上的羧基与1-蒽羰化青(AN)反应生成荧光性物质在FLD上检测,极限浓度可达3.5ng/kg。高效液相色谱-串联质谱联用技术检测灵敏度能够达到40ng/kgP-CTX-1或100ng/kgC-CTX,是非常灵敏、可靠的检测技术。5.2azs检测方法一般在精神药品中,在检测azAZAs主要引起人体骨肠道紊乱,与腹泻性贝毒(DSP)和细菌性肠毒素引起的人体中毒症状极其相似。AZAs毒性比较稳定,常规的烹饪和加工处理无法去除,其毒性远比OA强,目前还没有找到有效的治疗方法和治疗药物。AZAs的现有检测方法基本上集中于小鼠生物测定法和高效液相色谱法,其中以液相色谱-串联质谱联用技术(LC