发酵工艺学课件：第三章 发酵工艺条件的确定

第三章发酵工艺条件的确定第一节培养基的选择和确定第二节培养条件的确定一、发酵生产中的培养基类型

工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为斜面培养基种子培养基发酵培养基第一节培养基的选择和确定1．斜面培养基作用：供微生物细胞生长繁殖用，包括细菌，酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸皮培养基等。对于放线菌或霉菌产孢子培养基，氮源和碳源不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成孢子。2.种子培养基(包括摇瓶种子和小罐种子培养基)培养种子的目的：1.扩大培养，增加细胞数量；2.同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。种子培养基特点：1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。2.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。3.发酵培养基1.提供必要的营养成分2.配制合适的浓度：从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。3.主成分与其他成分的配比。4.控制合适的pH5.避免产生沉淀。6.注意代谢调节物的影响。配制注意事项：

注意代谢调节物的影响有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。前体物质诱导剂阻遏物抑制剂金属离子(1)添加前体物质前体：是指某些化合物添加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物量提高。在发酵中添加前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量，如苯乙酸及其衍生物被认为是青霉素的前体物质。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136用法：流加，利于提高转化率前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利

苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化。(2)添加诱导物目前工业用微生物酶多数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。酶的正常底物或底物类似物都可作为诱导物。在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导物，例如淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。只有添加这些物质的培养基，才能获得高产。(3)注意阻遏物或抑制剂的影响培养基中存在反馈阻遏物能影响酶的合成，降低发酵产量。

(4)金属离子的影响有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感，因为有些金属离子是中间代谢酶抑制剂或激活剂。对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用，而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的。二、培养基组成碳素化合物氮素化合物水微量元素(无机盐类)生长因子碳源种类糖：己糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖，多糖中淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等。有机酸如柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等。醇类中甘露醇、甘油、低浓度的乙醇。脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用作碳源。油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用，低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒害作用。

正烷烃葡萄糖：是最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。过多葡萄糖会加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要。油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，氧化成水和CO2。因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。淀粉：一般要经菌体产生胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄糖代谢过快的弊病。来源丰富，价格低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉。糖蜜：是制糖厂生产糖时的结晶母液，含有较丰富的糖、含氮化合物和维生素等。例：地衣芽孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物：胶体成分（结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）例：柠檬酸发酵有害物：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐氮的来源可分为无机氮和有机氮有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。(2)氮素化合物

玉米浆：玉米淀粉生产中副产物，其中固体物含量在50％。还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素等。由于玉米浆的来源不同，加工条件也不同，因此玉米浆的成分有较大波动。无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。微生物对其吸收利用比有机物快，所以也称速效氮。利用无机氮时应注意引起的pH变化。实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等作为氮源，工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。无机元素包括主要元素(又称大量元素)和微量元素两类，这是依据微生物对它们需要量的大小划分的。主要元素有P、S、Mg、K、Ca等；微量元素有Fe、Cu、Mn、Zn、Mo等。当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。

一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料等都含有微量元素。(3)微量元素(无机盐类)

(4)生长因子

广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，仅指维生素。与微生物有关的维生素主要是B族维生素，是各种酶的活性基团的组成部分。三、培养基确定方法（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。（2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解.（3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。摇瓶优化注意培养过程中的pH变化，观察适于菌种生长繁殖和适于代谢产物形成的两种不同pH。其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响。pH控制摇床（4）有些发酵产物，如抗生素，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物途径。（5）根据经济效益选择培基原料。碳源的代用方向主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖。同时，使用稀薄的培养基，适当减少碳氮配比。有机氮源代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料。代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、酒糟及各种食品工业下脚料等。第二节培养工艺的确定温度pH值

氧种龄接种量一、培养条件1.温度

任何微生物生长都需有最适的生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的现实意义。温度影响发酵方向四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度。2．pH值

微生物通过其活动能改变环境pH值。控制发酵液pH值是控制生产的指标之一，pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。

培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后产生NH3，则pH上升；阳离子(如NH4、K+)被吸收或有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。

pH的控制1.可在培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基pH，也应在配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分。2.还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况.1.控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸盐作为磷的成分；或者避免使用容易产生生理酸性或碱性、使培养基pH波动太大的物质。2.pH过低时，加尿素、硝酸钠、氨水、蛋白质，增大通风量；过高，加糖、乳酸、醋酸、油脂等碳源，减少通风。具体方法3.氧——通风和搅拌

通气可以供给大量的氧。通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。CCrQO2CLCCr:

临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶解氧浓度。

溶解氧(DO)是需氧微生物生长所必需。搅拌能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。挡板则有助于搅拌，使其效果更好。一般来说，若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，利于氧的溶解。搅拌可提高通气效果，但过度地剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。新疆威仕达生物工程有限公司设备局部上海豫园生物工程有限公司发酵车间局部利用透明颤菌血红蛋白（VHb）基因工程菌解决溶解氧不足透明颤菌血红蛋白（VHb）是由透明颤菌属微生物产生的一种蛋白，使透明颤菌这一专性好氧的细菌可在贫氧环境中良好生长。其增加氧的传递。将透明颤菌血红蛋白基因整合到异源宿主菌中可解决溶解氧不足，提高发酵产量。溶解氧作为发酵异常情况的指标1发酵中污染好气性杂菌－发酵2～3小时时溶解氧迅速下降2污染噬菌体－菌液变稀，溶解氧回升3工艺错误、操作故障4.种龄与接种量

种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。接种量的大小直接影响发酵周期。大量地接入培养成熟的菌种的优点：1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，2.有利于减少染菌接种量过多也无必要。培养种子费时，且过多地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。

主要培养方法及特点

1．种子扩大培养阶段(1)液体培养法包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。(2)表面培养法包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。(3)固体培养法包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等。二、菌种扩大培养

克氏瓶，茄子瓶卧式旋转摇床立式旋转摇床2．大规模生产阶段

(1)表面培养(2)固体培养(3)液体深层培养(1)表面培养氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。(2)固体培养固体培养特点：①原料：以谷物和农业废物为原料，培养基简单。②防止污染：利用霉菌能在水分较低基质表面增殖特性，而细菌生长不好。③通气：可在曲房周围使用循环的冷却增湿空气来控制温湿度。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。

(3)液体深层培养

从液体深层发酵罐底部通气，送入空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中离子浓度等条件，选择最佳培养条件。

深层培养基本操作的3个关键控制点

①灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。

②温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水流过。③通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH而使加入的酸和碱分散等。新疆威仕达生物工程有限公司设备局部几种深层培养法

①两步法②控制培养法

③连续培养法④分批发酵法(间歇发酵法)⑤补料分批培养法(流加法)

①两步法酶制剂生产:将菌体生长条件(营养期)与产酶条件区分开。菌种先在丰富培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分利用。ScaleWeightSignalPumpSpeedAmplifierControllerSupervisoryComputer②控制培养法

发酵控制Fermentationcontrol③分批发酵法(间歇发酵法)

先将空罐杀菌，培养基装入发酵罐，接种之后进行培养，在培养过程中，培养基成分减少，微生物增殖。环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。不易染菌。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。

④连续培养法

在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，叫作连续培养法。使微生物处于恒定环境中进行长期持续培养。同时