DNA提取和制备解读

第一局部DNA提取总论一、提取DNA总的原则：1保证核酸一级构造的完整性；2其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。二、样原来源：理论上全部有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA样本选择取决于试验目的全血是基因组提取最常见的样本血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织〔包括骨髓〕和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆〔血清〕标本占分子诊断的60%以上DNA提取前样本采集、预处理和保存：〔一〕全血1.抗凝剂EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂不宜使用肝素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80℃保存2个月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差〔二〕血浆和血清血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标原来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测.三、DNA的收率样本类型基因组DNA收率20mg肝脏组织8

g100mg豆苗10

g100

l全血2

g2

106培养细胞10

g四、DNA提取的根本步骤1、核酸的释放：裂开细胞释放核酸〔机械法与非机械法〕2、核酸的分别与纯化3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤4、DNA鉴定：浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定

五、DNA提取试验中常遇到的问题基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞裂开不够充分，DNA释放不完全离心力偏小两相分别不完全……DNA降解的缘由样本不够新颖，采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的缘由？提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未去除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组DNA，有时参与蔗糖的缘由参与多糖，疼惜DNA长度不行无视的细节

—血液基因组提取天根生化科技〔北京〕没有严格要求:PCRSouthernBlotsRFLP严格要求片段长度:

构建文库

PFGE(脉冲场凝胶电泳)DNALengthDNA提取原则1：DNA片段长度没有严格要求

常规PCR严格要求产物纯度存档、产物长期保存Southern杂交荧光定量PCRSNPMicroarrayCGH(比较基因组杂交)DNA提取原则2：DNA产物纯度基因组提取方法溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵敏可变，得率高硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸磁珠法：独特包埋的磁珠，在确定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件转变时，磁珠释放吸附的核酸，能够到达快速分别纯化核酸的目的。传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，本钱低。但酚氯仿有毒，危害身体安康。样本保存和前处理－抗凝血液保存柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反响有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。

参与抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴快速溶解。

2.抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取试验所需的体积。样本保存和前处理－非抗凝血保存非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月；-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理

1.冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。

2.血凝块取出后先实行机械裂开的方法〔例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆〕将血凝块裂开，然后再依据自己的试验取适量样本。血凝块前期裂开程度越高，提取基因组就越简洁！样本保存和前处理－白膜层保存全血分别得到的白膜层放置-20℃或-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。

2.冻存的白膜层使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。

3.虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液还是必要的，但用量减半。4.承受白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需依据全血体积进展操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要参与提取1ml全血的试剂量。样本保存和前处理－血清/血浆保存现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进展争论，例如：肿瘤争论。分别得到的血清/血浆放置-70℃保存。尽量避开样本反复冻融。样本前处理

1.冻存的血清/血浆使用前溶解应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。

2.血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。

3.只需100-200ul样本，根本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。样本保存和前处理－微量血液/干血点/羊水/胸水保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存；

干血点：枯燥后室温或4℃保存；

羊水：-20或-70℃保存。样本前处理

1.微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进展红细胞裂解步骤。

2.干血点参与缓冲液直接进展提取。

3.羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进展裂解提取核酸。样本保存和前处理－口拭子/漱口水保存口拭子：枯燥后室温保存

漱口水：4℃保存或离心得到沉淀-20℃或-70℃保存样本前处理

1.拭子将拭子棉头剪入到离心管里，参与缓冲液直接进展提取。

2.有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进展核酸提取。

3.漱口水先进展离心得到沉淀再进展核酸提取。基因组提取流程加入吸附柱缓冲液漂洗DNA洗脱收集样本裂解纯化去蛋白沉淀核酸洗涤去盐溶解DNA沉淀样本裂解溶液法〔盐析法〕吸附柱法红细胞裂解哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取特殊重要。红细胞裂解有两种方式：承受红细胞裂解液进展裂解〔通常红细胞裂解液依据3倍全血体积参与进展裂解).承受细胞裂解液进展裂解〔TIANGEN的细胞裂解液CL是依据2.5倍全血体积〕，细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更便利基因组DNA的提取。红细胞裂解充分的现象：

得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进展两次裂解，留意其次次参与裂解液后需要将沉淀votex彻底混匀。核细胞裂解假设有裂红的步骤，请尽量将上清去除再参与裂解液。参与裂解液〔如：TIANGEN试剂盒中的GB或FG〕和蛋白酶K需要彻底混匀。将沉淀打散混匀后再进展水浴。水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进展下步操作，通常水浴时间10-30min.假设承受有机〔酚/氯仿〕抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分别两相时，应保证确定的转速和时间，且吸取上清时留意不要吸取到中间层及有机相。核酸吸附或沉淀硅胶膜吸附法

1.参与乙醇颠倒混匀后可能会消逝絮状沉淀，动作要轻柔。

2.将裂解的溶液和絮状沉淀全部参与到吸附柱里，此时的溶液应是高盐低pH值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅胶膜上。溶液法

1.当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。

2.参与异丙醇颠倒混匀后应消逝丝状沉淀，动作要轻柔，避开基因组因过于猛烈的外力而降解。

3.分别沉淀的方法：a.用枪头留神地将丝状沉淀挑出；b.离心分别，应保证确定的转速和时间。核酸洗脱或溶解硅胶膜吸附法

1.用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心以去除残留的液体及挥发乙醇成分。参与适量洗脱液TBbuffer〔或自己配制的buffer〕后放置5-10min后再进展离心得到基因组DNA。溶液法

1.使用70-75％乙醇对核酸沉淀进展洗涤。溶解DNA前需要室温或37℃放置几分钟晾干核酸〔使乙醇挥发〕，然后再参与适量的TBbuffer〔或自己配制的buffer〕溶解DNA。浓度：100－300ng/ul纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。温度：纯化得到基因组DNA之后需将DNA溶液分装保存到-20℃，反复冻溶会导致DNA的降解。溶解DNABuffer：纯化得到的基因组DNA最好溶解在TBBuffer(TIANGEN)或者Tris缓冲液里，由于大片段的基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。核酸保存纯度〔OD260-320/OD280-320〕紫外分光光度计进展测量〔选择正确的稀释倍数，确保OD260值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释4－5倍；溶液裂解法稀释20－30倍〕

OD260-320/OD280-320<1.7说明有蛋白的污染

OD260-320/OD280-320＝1.7～1.9说明纯度很好

OD260-320/OD280-320>1.9说明有局部降解或有RNA污染得率紫外分光光度计进展测量

Yield＝OD260×50ng/ul×稀释倍数DNA检测方法－紫外分光光度法Tiangen产品提取得率产品具体细节请直接点击产品名称样本处理量DNA/RNA得率（μg）推荐试剂盒哺乳动物全血100μl2DP327-磁珠法基因组提取试剂盒DP316-微量样品基因组DNA提取试剂盒200μl4-12DP318-血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)600μl12-201ml4-30DP319-血液基因组提取试剂盒(0.1-20ml)5ml100-20020ml300-700禽类、两栖类全血5-205-40DP318-血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)血凝块200-500ul1-8DP318/DP319500-1000ul8-15DP318/DP3191ml-5ml5-150DP319口腔拭子1个0.5-3.5DP322-口腔拭子基因组提取试剂盒DNA检测方法－电泳检测取2μl洗脱液1%琼脂糖凝胶电泳,检测DNA分子大小，纯度以及完整性TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒提取一样血样不同起始体积的DNA电泳图电泳检测要把握上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确推断。假设加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。假设上样量适宜，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNA有降解。TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样原来源全都，分别取1μl，10μl，50μl，100μl为起始样本提取基因组。各取2μl基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析试验结果。DNA检测方法－荧光定量PCR检测微量样本基因组DNA的检测通常承受荧光定量PCR检测，例如：干血点、微量血液等。试剂选择指南硅胶膜吸附法微量样本（DP316）口拭子（DP322）