籼型两系水稻代换系耐冷性评价

籼型两系水稻代换系耐冷性评价

水稻是一种喜热作物，低温冷害是水稻生产的主要障碍之一。全球每年约有0.15亿hm2水稻受到寒冷胁迫,在南亚和东南亚约有700万hm2面积因低温影响不能种植现代水稻品种,我国每年因冷害损失稻谷30亿~50亿kg。水稻芽期和苗期冷害是我国长江流域早稻区和云、贵、川一季中稻区生产中的重要影响因子,这些稻区在水稻生长前期常遇寒潮袭击,气温往往下降到15℃以下,非耐冷品种幼芽和幼苗停止生长,易导致烂秧、死苗或弱苗,抽穗分散,成熟期不一致,严重影响水稻生产。研究水稻在低温胁迫下的耐冷机制,利用分子生物学的手段,培育耐冷水稻品种是解决水稻生产中冷害问题的重要途径。水稻植株的耐冷性是一个复杂的数量性状,且具有生长阶段的特异性。许多学者对水稻芽期和苗期耐冷性、耐冷机制和遗传机理进行了大量研究。Baruah等比较了57个栽培稻和普通野生稻的低温发芽力、芽期和苗期耐冷性,发现粳稻芽期和苗期耐冷性明显强于籼稻和普通野生稻,并利用RILs群体将粳稻Hokkaido芽期和苗期耐冷性QTL定位于第1、5、11、12染色体;Zhang等和陈玮等利用Lemont/特青构建的RIL群体,定位了4个芽期耐冷性QTL,其中qSCT-11为主效QTL(LOD=19.19);严长杰等在南京11/巴利拉的DH群体中发现了一个与芽期耐冷性相关的基因(Cts7);乔永利等研究表明,粳稻吉冷1号的芽期耐冷性则由位于第2、4、7染色体上的2个部分显性QTL和1个加性QTL控制。杨杰等和巩迎军等分别对Nipponbare/Kasalath//Nipponbare和Koshihikari/Kasalath//Koshihikari构建的BILs群体,进行芽期低温处理,以处理后的活苗率作为评价指标,鉴定出4个来源于粳稻Nipponbare和Koshihikari的耐冷性QTL,4个来源于籼稻Kasalath的耐冷性QTL;Lin等也鉴定出4个来源于Nipponbare的芽期耐冷性QTL。Suh等则在苗期对温带耐冷粳稻Geumobyeo和热带粳稻IR66160-121-4-4-2构建的RILs群体进行耐冷性QTL分析,鉴定出2个位于第4染色体的耐冷性QTL。钱前等利用籼粳交DH群体将来自于粳稻京系17苗期耐冷性QTL定位于第1、2、3染色体,将来自于籼稻窄叶青8号苗期耐冷性QTL定位于第4染色体。Lou等通过将耐冷品种AAV002863与珍汕97B构建的DH群体幼苗在6℃/10℃处理7d,分析恢复培养6d后的秧苗成活率,鉴定出5个LOD>4.0的主效耐冷性QTL;Koseki等将3叶期幼苗在4℃环境黑暗处理6d,对恢复培养后的生长情况进行分析,鉴定出3个苗期耐冷性QTL;Misawa等、Han等和夏瑞祥等也对水稻苗期的耐冷性进行了研究,并进行耐冷性QTL鉴定。但是利用同一群体研究芽期和苗期耐冷性的相互关系及遗传效应的报道较少,研究芽期和苗期耐冷性的遗传机理,对选育芽期和苗期均耐冷的品种,解决水稻生产上烂种和烂秧的问题,具有重要意义。单片段代换系是进行QTL定位的理想群体,它具有其他初级群体所不具有的优点,如群体稳定,遗传背景单一,无遗传背景干扰等,把控制复杂性状的QTL分解成单个孟德尔因子进行分析,提高了QTL鉴定的准确性。本研究利用测序品种(9311和日本晴)构建的单片段代换系对水稻芽期和苗期耐冷性进行分析,并进行耐冷性QTL鉴定,旨在为进一步研究耐冷基因及其遗传机制,选育耐冷型两系杂交稻新品种提供参考。1材料和方法1.1ssels—试验材料以籼型两系骨干亲本9311为受体亲本,粳稻品种日本晴(Nipponbare)为供体亲本构建的遗传稳定的单片段代换系BC5F4(singlesegmentsubstitutionlines,SSSLs)为材料。代换系导入片段鉴定和遗传背景筛选所用分子标记为微卫星标记。该套代换系由123个株系组成,代换片段平均长度为5.58Mb,全基因组覆盖率为63.72%。本研究选用具有代表性的92个株系作为试验材料。1.2种子催芽处理水稻芽期耐冷性鉴定参照杨川航等的方法。将供试种子置于45℃烘箱中处理48h,常温浸种48h,30℃下催芽24h;选取芽长约5mm的健壮芽谷均匀置于垫有两层滤纸的发芽皿中,每个发芽皿放置50粒,4次重复,加水保持湿润;将发芽皿放入4℃的恒温冰箱内,黑暗处理10d;取出置于30℃恒温培养箱中恢复培养5d;调查各发芽皿中的恢复成活苗数,计算恢复成活率(survivalseedlingrate)。将恢复成活率作为芽期耐冷性鉴定指标,其计算公式如下:恢复成活率(%)=(恢复成活苗数/出芽总粒数)×100。水稻苗期耐冷性鉴定参照徐云碧等的方法进行。将供试种子按上述方法正常催芽后,选取健壮芽谷播于孔径为6cm、装有湿润营养土的育秧盘内,每个材料播3穴,每穴20粒;将秧盘置于30℃培养箱中培养至3叶期;取出置于13℃白天/7℃晚上环境下处理10d;调查供试材料的卷叶程度,以正常叶片率(normalleafrate,NLR)作为苗期耐冷性的鉴定指标。正常叶片率(%)=(正常伸展叶片数/总叶数)×100。1.3农艺性状调查试验按NCⅡ设计,2011年冬在海南选择芽期和苗期耐冷株系用两系不育系Y58S和隐性核不育系ABCG15进行人工杂交,2012年正季将各组合F1种植于四川农业大学温江试验农场,种植与管理方式与大田相同,并进行农艺性状调查,成熟后每小区选取有代表性的5株考种。1.4代换片段长度计算采用SPSS数据分析软件进行方差分析、相关分析及显著性检测,用DPS2000数据分析系统进行配合力分析;QTL的鉴定按Zhu等的方法,通过t测验分析单片段代换系与受体亲本(9311)间的差异显著性,以P=0.001作为判定QTL存在的阈值;QTL加性效应值的估算参照Eshed等的方法。QTL代换作图参照Zhang等的方法;代换片段长度的计算按Xi等的方法;QTL命名遵循McCouch等的规则。2结果与分析2.1期耐冷性表现单片段代换系对芽期低温胁迫表现出不同的耐冷性(表1,图1)。方差分析表明,代换系间芽期耐冷性差异达极显著水平(F=6.987,P<0.001),芽期耐冷性表现出较大差异,并且表现为连续分布,表明芽期耐冷性为数量遗传性状。从恢复成活率上看,代换系X709、X712、X686和X729耐冷性较强(恢复成活率大于70.0%),耐冷性中等以上(恢复成活率大于50.0%)的代换系占34.0%。供体亲本日本晴芽期耐冷性极强,受体亲本9311耐冷性较弱,双亲耐冷性差异极显著(F=1080.310,P<0.001),粳稻亲本日本晴芽期耐冷性明显优于籼稻亲本9311及以9311为背景的单片段代换系。2.2不同品种水稻的抗冷性单片段代换系间苗期耐冷性也存在极显著差异(F=12.632,P<0.001),苗期耐冷性表现为连续分布(表1,图1),表明苗期耐冷性为数量遗传性状。正常叶片率数据表明,代换系X404、X634、X649、X732、X733和X738具有较强的苗期耐冷性(NLR>60.0%),耐冷性中等以上(NLR>50.0%)的代换系占21.74%。粳稻亲本日本晴苗期耐冷性较强,籼稻亲本9311苗期耐冷性极弱,双亲间差异达极显著水平(F=288.878,P<0.001)。粳稻亲本日本晴苗期耐冷性明显强于籼稻亲本9311及以9311为背景的单片段代换系。相关分析表明(图2),代换系芽期与苗期耐冷性相关性不显著(r=-0.082,P=0.432),但也存在芽期和苗期耐冷性均较强的代换系,如X733芽期耐冷性和苗期耐冷性都较强(恢复成活率为57.5%,正常叶片率为66.7%)。2.3农艺性状表现对芽期(恢复成活率大于50%)和苗期(正常叶片率大于50%)均表现耐冷的5个代换系进行了农艺性状分析(表2)。结果表明,代换系X719、X724和X733除穗长显著变化外,其余性状与受体亲本9311无显著差异;代换系X704千粒重极显著减小,其余性状与9311无显著差异;代换系X732株高和穗长极显著高于或长于9311,其余性状与9311相当,表明耐冷株系较好地保持了9311的农艺性状。对耐冷株系的配合力方差分析表明(表3),耐冷株系间在株高、结实率和产量配合力方面存在极显著差异。将耐冷株系的主要农艺性状一般配合力(GCA)与9311比较(表4),发现代换系X704结实率GCA和产量GCA均极显著低于9311;代换系X719和X733主要性状GCA与9311无显著差异,X733产量GCA较高;代换系X724株高GCA和结实率GCA显著低于9311,但产量GCA高于9311;代换系X732株高GCA显著高于9311,结实率GCA和产量GCA也较高。对主要农艺性状GCA的综合比较发现,代换系X724、X732和X733主要农艺性状GCA较强,产量GCA突出,具有较大的育种利用价值。2.4qtl分析2.4.1代换系芽期耐冷性发展本研究共检测到18个与芽期耐冷性相关的QTL,分布于除第1染色体外的11条染色体上(表5,图3)。检测到的QTL均为正向加性效应,且具有较大的加性效应,导入片段导致代换系芽期耐冷性增强。其中qCTP11.2加性效应最大(a=29.5),对应代换系平均恢复成活率达69.5%。另外,qCTP3.2、qCTP5.2、qCTP6、qCTP8、qCTP9、qCTP10.1、qCTP10.2、qCTP11.1、qCTP12.1和qCTP12.2加性效应也较大(a>20),所在代换系相比9311具有较强的芽期耐冷性。2.4.2抗冷性能分析本研究中共检测到5个苗期耐冷性QTL,分布于第1、7和12染色体(表6,图3)。检测到的QTL均为正向加性效应,且具有较大的加性效应(a>30),其中qCTS1.1加性效应最大(a=42.22),对应代换系苗期NLR为90.0%,具有较强的苗期耐冷性。芽期耐冷性qCTP12.1和苗期qCTS12.1以及qCTP12.2和qCTS12.2定位在同一区间,且加性效应均较大,表明利用分子标记选育芽期和苗期均耐冷的品种是可行的,且芽期和苗期均耐冷的株系X732和X733分别含有qCTP12.1和qCTS12.1以及qCTP12.2和qCTS12.2。3耐冷性各体性基因检测结果水稻籼粳亚种间的耐冷性具有较大差异,一般来源于热带的籼稻对低温较为敏感,而来源于热带和温带的粳稻具有较强的耐冷性,但是由于籼粳亚种间的杂交亲和性问题,粳稻中的耐冷基因很难被籼稻所直接利用。本研究利用回交和分子标记辅助选择的方法,通过测序品种籼稻9311和粳稻日本晴构建单片段代换系,将粳稻耐冷基因导入籼稻中,筛选出芽期和苗期耐冷性均较强的代换系X704、X719、X724、X732和X733。这些代换系较好地保持了9311的优良农艺性状,其中X724、X732和X733综合农艺性状优良,在产量GCA方面表现突出,可作为改良籼稻耐冷性的优良种质和选育耐冷杂交稻的优良亲本。另外,耐冷单片段代换系仅有单一片段来自供体亲本,其余背景与9311相同,因此,它们还是进行耐冷基因定位,克隆和效应分析的良好遗传基础材料,具有较大的应用价值。本研究共检测到18个芽期耐冷性QTL和5个苗期耐冷性QTL,检测到的QTL中,芽期耐冷性QTLqCTP3.1、qCTP4.1、qCTP5.1、qCTP5.2和qCTP11.2分别与Zhou等、杨杰等、巩迎军等、Lin等和杨川航等定位的芽期耐冷性QTL在同一位点,苗期耐冷性QTLqCTS1.1、qCTS1.2、qCTS7和qCTS12.2分别与Lou等、Andaya等和Han等检测到的苗期耐冷性QTL在同一位点外,其余均为新检测到的耐冷性QTL位点。研究还发现,第3染色体芽期耐冷性QTLqCTP3.1所在的RM426-RM8277区域与Fujino等定位的低温发芽力QTL,Han等定位的分蘖期耐冷性QTL在同一区域;第5染色体芽期耐冷性QTLqCTP5.2所在的RM3348-RM274区域与Xu等鉴定的孕穗期耐冷性QTL在同一区域;第7染色体苗期耐冷性QTLqCTS7所在的RM320-RM455区域与已报道的低温发芽力QTL、芽期耐冷性QTL和生殖生长期耐冷性QTL处于同一区域;第8染色体芽期耐冷性QTLqCTP8所在的RM22722-RM42区域、第9染色体qCTP9的RM410-RM201区域和第11染色体qCTP11.1所在的RM4-RM167区域存在与水稻多个生育时期耐冷性相关的QTL[5,20,24,39,41,42,43,44]。本研究中,第12染色体的RM1261-RM519区域和RM17区域,也同时检测到芽期和苗期耐冷性QTL。这些染色体区域可能是多个生育时期耐冷性QTL成簇分布区域,也可能是多效耐冷性QTL位点,这些区域和QTL的发现为了解水稻耐冷机制,研究耐冷基因,选育多生育时期耐冷品种提供参考。另外,分别将qCTP3.2、qCTP6、qCTP12.2和qCTS12.2定位于第3染色体RM85区域、第6染色体RM141区域、第12染色体RM17区域较小的染色体片段上(1.22Mb、0.89Mb、0.6Mb),且具有较大的加性效应(a=25.00,25.03,23.50,30.56)。这些与芽期和苗期耐冷性紧密连锁的微卫星标记可作为芽期和苗期耐冷品种的辅助选择标记,提高选育耐冷品种效率。水稻耐冷性具有群体和生育阶段特异性,不同鉴定群体的耐冷性QTL不同,同一鉴定群体在不同生育阶段的耐冷性QTL也不尽相同。本研究也表明水稻芽期与苗期耐冷性无显著相关性,芽期和苗期耐冷性QTL较少在同一