琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制学习动物的处死与组织匀浆的方法。学习离心机的使用方法。

进一步理解酶的竞争抑制原理。实验目的：实验原理：竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相比照例。草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内，琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后与氧结合生成水，并释放出能量。在体外那么可用甲烯蓝〔蓝色〕作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H而被复原为甲烯白〔无色〕。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。06二、实验原理

抑制剂和底物的结构相似，可与底物竞争酶的活性中心，阻碍酶-底物复合物的形成。酶的竞争性抑制作用抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相比照例〔[I]/[S]〕HOOC—CH2—CH2—COOHHOOC—CH=CH—COOHFADFADH2MBH2甲烯白〔无色〕MB甲烯蓝〔蓝色〕在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢酶活性的改变。草酸HOOC—COOH琥珀酸脱氢酶实验器材与试剂:〔一〕试剂pH=7.4的磷酸缓冲液0.25%琥珀酸钠溶液0.5%草酸钠溶液0.01%甲烯蓝溶液生理盐水液体石蜡实验器材与试剂：〔二〕器材研钵.手术剪.手术镊子2mL移液管1000uL微量可调仪器10mL离心管低速离心机实验操作：(1)肝糜液的制备用颈椎脱臼法处死小白鼠将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充分研磨至糊状分批参加磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液实验操作：

另取中试管5支，标号

琥珀酸脱氢酶活力的测定编号123450.25%琥珀酸钠溶液/ml0.50——0.502.000.500.5%草酸钠溶液/ml——0.500.500.502.00蒸馏水/ml2.002.001.50————肝糜液/ml1.001.001.001.001.0甲烯蓝/ml0.200.200.200.200.20摇匀，静置于37摄氏度的水浴中〔此后再勿摇动〕注意观察各管的颜色变化，记录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反响液，观察实验现象并分析产生该现象的原因。1>肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里2>离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要相等的离心管对称放置3>离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊本卷须知：思考题：

1:为什么反响开始后，反响液必须静止，不能在摇动?防止空气中的氧接触反响溶液，使的复原性的甲烯白重新氧化成甲烯蓝思考题：2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本实验成功的关键是什么？思考题：3：抑制剂还可以选用什么物质？还可以选用丙二酸4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点？竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反响产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；c.抑制剂浓度越大，那么抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参数：Km值增大，Vm值不变。思考题：5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺陷与改进方案？补充：琥珀酸脱氢酶〔Succinatedehydrogenase，简称SDH〕，黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受体的，另一种是作用于所有受体。琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种1.硫酸甲酯吩嗪〔PMS〕反响法2.铁氰化钾[K3Fe〔CN〕6]复原法3.TTC〔氯化三苯四氮唑〕法4.MTT法5.NBT〔氯化硝基四氮唑蓝〕法1.硫酸甲酯吩嗪〔PMS〕反响法琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS〔吩嗪二甲酯硫酸盐〕，DCPIP〔2，6-二氯酚靛酚〕等发生反响催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映，其反响式为：①Succinate＋PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这种色泽可因其复原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的复原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被复原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反响系统在600nm处的吸收光度变化，来计算SDH的活性。SDH活性计算：〔标准－测定〕/标准=μmol/min/mg。2.铁氰化钾[K3Fe〔CN〕6]复原法以铁氰化钾[K3Fe〔CN〕6]和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反响将铁氰化钾复原为亚铁氰化钾[K4Fe〔CN〕6]，K4Fe〔CN〕6再与Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱氢酶的复原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。3.TTC〔氯化三苯四氮唑〕法无色TTC〔2，3，5-氯化三苯基四唑〕作为人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，复原成三苯基甲膳〔TF〕。后者以红色晶体的形式存在于细胞内，采用有机溶剂〔如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等〕进行萃取。萃取液测定485nm吸光度后，以TTC复原量表示脱氢酶活性，根据标准曲线计算TF生成量，进而求出TTC-脱氢酶活性4.MTT法MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢复原MTT，同时在细胞色素C的作用下生成蓝色〔或蓝紫色〕不溶于水的甲臜〔Formazana〕，经异丙醇作用颗粒溶解显色。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度570nm处OD值推测出活细胞的数目。5.NBT〔氯化硝基四氮唑蓝〕法NBT易溶于水，呈淡黄色，以NBT为受氢体，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而形成紫蓝色的沉淀，于反响体系中参加PMS，混匀，37℃保温30min，之后参加TCA终止反响。加异丙醇溶解显色，混匀，即可于548nm测OD值。规定：30min内548nm下OD值为1.0时的酶量为1个活力单位。比活力=活力单位数/毫克蛋白。竞争性抑制的机理

⑴竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反响产物；⑵抑制剂与酶的结合部位〔活性中心〕与底物与酶的结合部位相同；⑶抑制剂浓度越大，那么抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；⑷动力学参数：Km值增大，Vm值不变。抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相比照例注意：结合在酶的同一部位以及结构类似并不是竞争性抑制的必要条件，抑制剂结合的部位阻碍底物和酶的结合，即产生空间位阻也可以造成竞争性抑制。琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是线粒体内膜的