人工虫草多糖对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响

人工虫草多糖对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响

麦冬草是麦角菌科的一种真菌寄生在蝙蝠和昆虫幼虫上的个体和尸体。这是中国的著名药物，与人参和鹿相似。近年来研究发现其富含虫草素、虫草酸和虫草多糖等生物活性物质,其中虫草多糖具有调节免疫功能、保肝保肾、防治急性肾衰竭、抗肝纤维化、抗炎、抗菌等多种药理作用,因而它对糖尿病及其并发症的防治作用逐渐受到广大学者的重视。黄志江等运用体外细胞培养法发现人工虫草多糖(polysaccharidesfromculturedmyceliumofCordycepssinensis,PCS)能促进胰岛素抵抗的脂肪细胞对葡萄糖的摄取水平,并推测其降血糖作用可能与促进外周组织的葡萄糖代谢有关。虽然已证实PCS有显著的降血糖作用,但在胰岛素抵抗模型动物体内的相关研究鲜有报道。因此,笔者在本研究采用FF/STZ诱导胰岛素抵抗2型糖尿病(type2diabetesrelatedinsulinresistance,T2DM-IR)模型,首次观察到不同剂量的虫草多糖改善T2DM-IR小鼠的作用,进一步探讨其可能的作用机制。1材料表面1.1酰甘油、总胆固醇、游离脂肪酸试剂盒虫草发酵菌丝体(杭州中美华东制药有限公司),链脲佐菌素(STZ,Sigma公司)、吡格列酮(Sigma公司),小鼠胰岛素ELISA试剂盒(USCNLIFESCIENCE&TECHNOLOGY公司),三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)测定试剂盒(上海名典生物工程有限公司)。怡成超越JPS-Ⅲ手持式快速全血葡萄糖测试仪(北京怡成生物电子技术有限公司)、低温高速离心机(Hermle公司,德国)、SPX型智能生化培养箱(宁波东南仪器有限公司)、AVE-852半自动生化分析仪(长沙爱威科技实业有限公司)。1.2粗品多糖的制备采取水煎醇沉法提取,固体发酵菌丝体样品阴干后粉碎过筛孔内径0.425mm(40目)筛,粗粉用10倍60～80℃的水浸5h,收集提取液,减压浓缩后按Sevag法去除蛋白,浓缩液以95%乙醇沉淀,经无水乙醇和丙酮脱水,收集白色沉淀干燥得粗品多糖,采用硫酸-苯酚法于波长625nm测定含量,得率为18.65%。2小鼠血糖等情况检测Balb/c小鼠,体质量18～20g,适应实验环境1周。给予高脂饲料喂养3周后,连续3d腹腔注射小剂量STZ(25mg·kg-1),继续高脂饲料喂养。2周后选择空腹血糖>7mmol·L-1作为糖尿病模型鼠。将50Balb/c小鼠随机分为正常组10只,其他40只建立糖尿病模型,成功后分为4组:模型组、阳性药物组(灌胃给予吡格列酮20mg·kg-1)及低、高剂量药物组(灌胃给予虫草多糖200,400mg·kg-1),每组10只。正常组和模型组给予等量的纯化水,qd,连续28d。动态监测血糖,末次给药前禁食12h,灌胃给予葡萄糖2.5g·kg-1,分别测定小鼠给予葡萄糖后0,0.5,2.0h的血糖值,比较给予葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积变化。血糖曲线下面积(AUC)=0.25×(0h血糖值+4×0.5h血糖值+3×2h血糖值)。小鼠摘眼球取血后,分离血清,-20℃冻存。按照酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)试剂盒说明书操作检测血清中胰岛素分泌水平,同时计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);血清TC、TG、FFA检测时严格按照试剂盒说明操作。采用SPSS13.0软件进行方差分析,实验数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,P<0.05表示差异有统计学意义。2.5降血糖、降脂和降血脂作用各组小鼠体质量在造模前差异无统计学意义(P>0.05),糖尿病小鼠实验期间摄食量高于正常组(P<0.05),由于摄入大量高热量的饲料,体质量增长较快,出现腹部肥胖症状。阳性药物组及高剂量药物组可有效降低糖尿病小鼠体质量增量(P<0.01或P<0.05),低剂量药物组则差异无统计学意义。结果见表1。结果见图1。实验期间糖尿病模型组显示持续的高血糖。高、低剂量药物组给药后血糖缓慢下降,与模型组比较均差异有统计学意义,尤以高剂量药物组降血糖作用明显(P<0.01),且与阳性药物组作用程度相当(P<0.01)。各组给予葡萄糖后,各组血糖值都有所升高,但在2h以后,除了模型组,其他各组血糖值都趋向正常。对比各组间的血糖曲线下面积(AUC)发现,高剂量药物组和阳性药物组可显著改善糖尿病小鼠糖耐量(P<0.01),低剂量药物组则作用稍弱(P<0.05)。见表2。图1进一步说明PCS高剂量(400mg·kg-1)的降血糖作用最佳。结果见表3。从表3胰岛素水平可知,各给药组均无促胰岛素分泌作用。MATTHEWS等在1985年提出的稳态模型法用于评价胰岛素抵抗状态,抵抗指数(HOMA-IR)=空腹胰岛素(μU·mL-1)×空腹血糖(mmol·L-1)/22.5。与模型组小鼠比较,各给药组均可降低糖尿病小鼠胰岛素抵抗指数,高剂量药物及阳性药物组作用更为显著(P<0.01)。因此,高剂量药物组的降糖作用可能与改善胰岛素抵抗有关。结果见表4。高剂量药物及阳性药物组可有效降低糖尿病TG、TC、FFA含量(P<0.05或P<0.01),说明400mg·kg-1PCS有着同吡格列酮相当的降血脂疗效。而200mg·kg-1PCS仅对降低TC水平有效(P<0.05),对TG及FFA均差异无统计学意义(P>0.05)。再次表明PCS高剂量的优越性。3tm-ir模型小鼠胰岛素抵抗和血脂水平的变化2型糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病,其主要的病理表现为胰岛素抵抗和胰岛功能的不足,其中胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生、发展中起着重要作用。因此,寻找改善胰岛素抵抗的药物是目前的研究热点。胰岛素作用受遗传和环境因素的影响。高脂饮食的摄入可能是影响胰岛素敏感性的一个重要因素。研究发现:高脂饮食能引起小鼠的糖耐量受损、TG、TC、血清胰岛素升高及胰岛素抵抗指数上升,具体表现在胰岛素刺激的肌肉、脂肪组织摄取葡萄糖的能力下降,以及胰岛素抑制肝糖异生能力的下降等,这与临床上胰岛素抵抗2型糖尿病患者的相关症状符合。本研究合并使用小剂量STZ多次注射,在小鼠胰岛素抵抗的基础上进一步抑制其β细胞功能,成功的建立了T2DM-IR模型,并观察PCS对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响及可能的作用机制。本实验初步观察了PCS对糖尿病小鼠血糖调节的影响,结果显示,400mg·kg-1PCS可有效降低小鼠空腹血糖值及体质量增长速率,但不改变摄食量(P>0.05),说明降血糖作用并非通过控制摄食量,而是PCS本身药理活性所决定的。同时,PCS还可降低糖尿病小鼠血胰岛素水平、改善胰岛素抵抗及糖耐量等。在空腹血糖下降的同时,空腹胰岛素亦明显下降,提示PCS降血糖是通过降低高胰岛素血症,增加受体对胰岛素的敏感性而起作用,而没有刺激胰岛β细胞分泌胰岛素,这在一定程度保护了胰岛β细胞的功能。此外,400mg·kg-1PCS还可显著改善T2DM-IR模型小鼠高血脂水平,恢复TG、TC、FFA的正常水平。T2DM-IR模型小鼠高胰岛素与胰岛素抵抗可促进细胞内TG的分解及FFA进入血液循环,并伴随脂肪细胞对FFA吸收下降,导致血中FFA浓度增加造成脂代谢紊乱。胰岛素可以阻断TG在肝组织或者脂肪组织的分解,从而减少血中FFA的浓度,同时还可以通过减少环磷酸腺苷(cAMP)浓度来抑制脂质代谢,提示PCS可能通过改善胰岛素抵抗,增加胰岛素的敏感性和扩大胰岛素传导的效应性,进而发挥降低脂质和调节脂质紊乱的作用。综上所述,PCS能够在一定程度上降低血糖血脂和血清胰岛素水平,阻止胰岛素抵抗的发生、发展,提高机体的胰岛素敏感性,说明该中药作为胰岛素增敏剂具有较广的临床应用前景,但如何增强胰岛素敏感性以及促进外周组织葡萄