肉鸡屠宰前沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

肉鸡屠宰前沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

沙门氏菌是一种常见的人类疾病。这种菌广泛分布于自然界，主要寄生在动物和昆虫身上。发现了2500多种血清素。目前,沙门氏菌中毒事件已呈全球分布,据资料统计,在我国细菌性食物中毒中,有70%~80%由沙门氏菌引起,而在引起沙门氏菌中毒的食品中,约90%是肉、蛋、奶等畜禽产品。鸡肉是我国主要的动物性食品之一,肉鸡在养殖过程中容易受到沙门氏菌感染,且在其屠宰加工过程中,存在着交叉污染情况,不同环节都容易造成沙门氏菌的污染、传播,因此,实时检测肉鸡屠宰加工过程不同环节中沙门氏菌的污染分布情况,对确保鸡肉安全和食品安全有重要意义。抗生素的滥用造成大量耐药菌株的出现,相关数据表明,沙门氏菌对常用抗菌药物的耐药率随着时间的推移,呈上升趋势,且其耐药性能通过食物链传播到人群,对公共卫生安全构成严重的危害。目前,对肉鸡屠宰加工过程中不同环节沙门氏菌的污染分布研究较少。采用GB4789.4—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》方法检验沙门氏菌操作繁琐、耗时耗力,灵敏度差,PCR方法因其快速、灵敏度高、特异性强等优点广泛应用于细菌鉴定中,尤其是多重聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术在食源性致病菌的检验和鉴定上已得到较好应用。目前,在沙门氏菌的PCR检测中最常用的靶基因为invA基因和hut基因。本研究通过对四川某重点肉鸡养殖场和肉鸡屠宰加工厂不同加工环节中沙门氏菌进行分离鉴定,了解沙门氏菌在不同加工环节中的污染分布及耐药情况,为兽医临床用药提供数据参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1肉样的采集自四川省某重点肉鸡养殖、屠宰场采集屠宰前肉鸡粪样、屠宰加工不同环节的胴体表面样品(冲洗水)、分割鸡肉样以及冷冻鸡肉样,低温运回实验室。1.1.2蘑菇肠炎沙门氏菌CICC21482、大肠杆菌ATCC25922四川农业大学食品微生物实验室保存。1.1.3细菌、菌株和引物的设计与合成根据文献[9-10]针对沙门氏菌的invA基因和hut基因,设计两对特异性引物,细菌16SrDNA的PCR扩增采用通用引物(表1),由大连宝生物工程有限公司合成。1.1.4培养基和培养基四硫磺酸钠煌绿增菌液(tetrathionatebrothbase,TTB)、亚硒酸盐胱氨酸(selenitecystine,SC)增菌液、胆硫乳(deoxycholatehydrogensulfidelactose,DHL)琼脂、三铁糖琼脂、赖氨酸脱羧酶肉汤管、营养肉汤、缓冲蛋白胨水(bufferedpeptonewater,BPW)、(Mueller-Hinton)MH琼脂青岛高科园海博生物技术有限公司;沙门氏菌显色培养基法国科玛嘉公司。1.1.5应试剂及网络原料DL2000DNAMarker、PCR反应试剂、GoldviewTM核酸染料宝生物工程(大连)有限公司;BioWest琼脂糖美国Bio-Rad公司;其余试剂为分析纯或生化试剂。1.1.6氨基糖苷类、四环素类、磺胺类青霉素类:氨苄西林(ampicillin,AMP,10μg/片)、阿莫西林/克拉维酸(amoxicillin/clavulanicacid,AMC,20/10μg/片);头孢类:头孢曲松(ceftriaxone,CRO,30μg/片);氨基糖苷类:庆大霉素(gentamicin,GEN,10μg/片)、大观霉素(spectinomycin,SPE,100μg/片);四环素类:四环素(tetracycline,TET,30μg/片);氯霉素类:氟苯尼考(florfenicol,FLO,75μg/片);磺胺类:甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(trimethoprim/sulfamethoxazole,SXT,1.25/23.75μg/片);喹诺酮类:萘啶酸(nalidixicacid,NAL,30μg/片)、环丙沙星(ciprofloxacin,CIP,5μg/片);以上试剂均购自赛默飞世尔生物化学(北京)有限公司。1.1.7恒科技有限公司BSC-1300ⅡA2型生物安全柜苏州安泰空气技术有限公司;DHP-9162恒温培养箱上海一恒科技有限公司;SORVALL离心机美国科俊仪器有限公司;Milli-Q超纯水系统美国Millipore公司;C1000ThermalCyclerPCR仪、PowerPacBasic电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统美国Bio-Rad公司。1.2方法1.2.1样品采集沿肉鸡屠宰加工不同环节分别取样。肉鸡屠宰加工流程及采样点见图1。所有样品均低温保存运回实验室,待检。1.2.2不同浓度的ctp扩增液对猪肉的增菌剂无菌条件下,将蘸有粪样的棉签放置于3mL无菌生理盐水中,浸提15min,取浸提液0.2mL加入3mL无菌TTB和SC增菌液中混匀,分别在42℃(TTB)和37℃(SC)条件下增菌培养24h;取鸡肉25g加入225mL无菌缓冲蛋白胨水,浸提15min,4℃、10000r/min离心10min,沉淀用1mL无菌生理盐水溶解后,取0.2mL用于增菌;污水样经4℃、10000r/min离心10min,沉淀用1mL无菌生理盐水溶解后,取0.2mL用于增菌,方法同前。1.2.3沙门氏菌的分离取增菌培养液5μL划线接种于DHL琼脂平板,挑取典型菌落划线沙门氏菌显色平板,进行纯化,筛选出疑似沙门氏菌。1.2.4风险检验按照GB4789.4—2010方法,对分离出的疑似沙门氏菌进行三铁糖琼脂培养和赖氨酸脱羧酶实验,并按标准进行疑似沙门氏菌的判读。1.2.5沙门氏菌分离的双重pcr试验1.2.5.1.提取细菌总dna采用热裂解法提取细菌DNA。1.2.5.pcr扩增hut基因疑似沙门氏菌二重PCR扩增反应体系:反应总体积为25.0μL,两对引物浓度比例为c(invA)∶c(hut)=1∶3,其中10×PCRBuffer2.5μL,MgCl2(25mmol/L)1.5μL,dNTP2μL,invA基因上下游引物各0.5μL,hut基因上下游引物各1.5μL,DNA2.0μL,ddH2O13.0μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性40s,60℃退火40s,72℃延伸50s,40个循环,72℃延伸5min。PCR产物于1.5%的琼脂糖(0.5×TBE)凝胶电泳后,观察并成像。16SrDNA的PCR扩增:PCR反应体系(50μL)为上、下游引物各2μL(10μmol/L),模板DNA2μL,10×PCRBuffer(Mg2+Free)5μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,dNTP4μL,TaqTM(2.5U/μL)1μL,ddH2O31μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min;94℃,45s,56℃,45s,72℃,1.5min,循环30次;72℃延伸10min。PCR产物电泳检测后送华大基因(上海)测序部进行序列测定。1.2.5.pcr扩增实验取肠炎沙门氏菌标准菌株CICC21482、大肠杆菌ATCC25922的DNA,同时设计不加模版、只加单侧引物两组对照,进行二重PCR引物特异性实验。1.2.5.pcr扩增片段的分析对肠炎沙门氏菌标准菌株CICC21482invA和hut基因扩增片段进行胶回收后由华大基因公司克隆测序,并进行序列分析。同时,随机挑取二重PCR鉴定的沙门氏菌阳性菌株进行16SrDNA的PCR扩增,其扩增产物回收纯化后送华大基因公司克隆测序。1.2.6污染率计算经上述分离鉴定出沙门氏菌的样品为阳性样品,从每一份阳性样品中获得并保存一株沙门氏菌菌株。1.2.7沙门氏菌分离株的检测采用临床和实验室标准化研究所(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)推荐的纸片扩散法,对沙门氏菌分离株进行10种临床常用抗菌药物的抑菌直径测定,以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株,按照CLSI标准进行操作和结果判断。2结果与分析2.1连接沙门氏菌的分离培养根据菌落形态从DHL平板和科玛嘉显色平板上挑取疑似沙门氏菌,通过三铁糖琼脂穿刺培养和赖氨酸脱羧酶实验结果,从1350份样品中分离筛选得到疑似沙门氏菌阳性样品160份。2.2引物的扩增效果对所设计的两对引物进行特异性验证,结果如图2所示,肠炎沙门氏菌CICC21482能扩增出2条目的片段,其余对照均未扩增出片段,说明所设计的两对引物特异性可靠。2.3inva基因序列及同源性分析以肠炎沙门氏菌标准菌株CICC21482的DNA为模板,扩增invA和hut基因单一基因产物序列分析表明,invA和hut基因PCR产物纯化后克隆测序分别得到长约为284、495bp的片断,与设计大小相符,测得序列已在美国国立生物技术信息中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)注册,登录号分别为KF547932、KF547931;采用BLAST和DNASTARMegAlign进行基因比对分析。invA(KF547932)与沙门氏菌登录号EU348368.1、DQ644627.1等的invA基因序列有99.3%的同源性;hut(KF547931)与沙门氏菌登录号V01372.1、V013723.1等的invA基因序列有99.2%的同源性;进一步表明该方法正确和特异。2.4沙门氏菌阳性菌株的筛选160株疑似沙门氏菌的二重PCR产物的部分电泳结果如图3所示。156株菌均同时扩增出284bp和495bp的特异性片段,判断为沙门氏菌阳性菌株。由此得出,所采集的样品有156份为沙门氏菌阳性。2.51沙门氏菌同源性分析结果随机挑取两株二重PCR鉴定为沙门氏菌的阳性菌株,进行16SrDNA扩增,PCR扩增产物经测序后得到长约1465bp的片段,通过NCBI上的BLAST程序和DNASTAR的MegAlign软件进行比对分析,得出该两株菌的同源性达到100%,且其与登录号为FJ465088.1、EU118105.1的肠炎沙门氏菌同源性均达到99.0%~99.6%,由此可见,该两株菌均为肠炎沙门氏菌,进一步表明invA和hut基因的二重PCR方法鉴定沙门氏菌结果准确。2.6鸡肉中沙门氏菌的污染由图4可知,屠宰前(即养殖场)肉鸡沙门氏菌污染率为13.53%(82/606)。肉鸡经烫毛脱毛处理后,肉鸡表面的沙门氏菌检出率为0;经开肛处理后,肉鸡表面沙门氏菌的污染率为7.23%(12/166),可能是在开肛过程中,部分肠道内容物的溢出,污染鸡肉表面所致;取出内脏后,鸡肉表面及其胴体冲洗水中,沙门氏菌的污染率分别为9.80%(10/102)和11.54%(69/78),其污染率较之前环节上升,其原因是在于取出内脏环节,肠道内容物可能溢出,污染鸡肉表面。鸡肉分割链条中,沙门氏菌的污染率为14.5%(29/200),经冷冻处理后,鸡肉中沙门氏菌的污染率为9.33%(14/150)。肉鸡屠宰加工过程中沙门氏菌的污染率呈现先下降后上升,再下降的趋势。2.7抗菌药物耐药结果根据CLSI(2010)标准,对药敏结果进行判读,统计出耐药和中介耐药沙门氏菌菌株数,并计算沙门氏菌分离株对各种抗菌药物的耐药率。本研究中156株沙门氏菌分离株对10种抗菌药物(组合)的耐药率统计见图5。由图5可知,沙门氏菌分离株对萘啶酸和氨苄西林的耐药率最高,分别为100.00%、85.90%,对SXT(44.23%)、GEN(39.10%)、TET(35.26%)、SPE(21.79%)的耐药率较高;对FLO(19.23%)、CIP(14.10%)和AMC(6.41%)的耐药率较低,但对AMC的中介耐药较高,为32.69%,对CRO耐药率低,仅为1.92%。多重耐药率(耐3种药物及以上)为51.28%。2.8鸡马立克氏体菌的耐药谱肉鸡屠宰加工过程中分离的156株沙门氏菌对10种抗菌药物(组合)产生了39种耐药谱耐药谱,NAL、AMP优势明显,为85.90%(134/156);屠宰前(养殖场)肉鸡沙门氏菌分离株对10种抗菌药物(组合)产生了24种耐药谱,肉鸡屠宰环节(脱毛、掏膛、冲洗)沙门氏菌分离株对10种抗菌药物(组合)产生了12种耐药谱,分割及冷冻鸡肉中沙门氏菌分离株对10种抗菌药物(组合)产生了20种耐药谱,在肉鸡屠宰加工过程中,从上游屠宰前(养殖场)肉鸡,到下游屠宰加工后的鸡肉成品,沙门氏菌分离株的耐药谱有先变窄后上升的趋势,其原因可能是由于在鸡肉的生产环节中,从养殖到屠宰环节,再到鸡肉成品,沙门氏菌的污染率先下降再上升有关。本研究结果显示,所有受试沙门氏菌,共发现156株对10种抗菌药物(组合)产生不同程度的多重耐药性,耐3~5种药物的46株(29.49%),耐6~9种药物的38株(24.36%),其中耐6、7种药物的均为15株(9.62%),有3株(1.92%)沙门氏菌对9种抗菌药物具有耐药性,不同环节菌株对抗菌药物(组合)的多重耐药情况见图6。3沙门氏菌污染率的变化invA和hut基因常用于沙门氏菌的二重PCR鉴定中,克服了针对某单一基因设计的引物其灵敏度和特异性难以满足现阶段的检测要求,Cocolin、陈晓玲等利用invA和hut基因设计单一引物分别扩增出大小为284bp和495bp的片段,邵碧英等建立了invA和hut基因的多重PCR检测方法,其检测结果与预期一致。本实验运用此方法,并进一步采用16SrDNA序列分析,结果说明invA和hut基因的两对引物准确可靠。本研究将传统的平板分离和PCR技术相结合,分析了肉鸡屠宰加工不同环节中沙门氏菌的污染和耐药情况,获得了较为全面系统的数据。结果发现,肉鸡屠宰加工不同环节中沙门氏菌的污染率差异明显。在屠宰前(养殖场)肉鸡的粪样中沙门氏菌污染率较高,为13.53%,与张秀丽等的报道较为相近,高于侯小刚的报道;从养殖场到屠宰加工的各个环节,沙门氏菌污染率呈现先下降后上升、再下降的趋势,尤其在冷冻保存后,沙门氏菌的污染率下降,这可能是由于污染沙门氏菌菌量少的肉品在冷冻过程中,低温使其失活所致,但污染菌量较多的肉品可能导致部分沙门氏菌存活,当温度适宜其生长时,其有可能进行生长繁殖,存在潜在风险;在屠宰加工环节中,沙门氏菌的污染率在分割后的鸡肉中达到最高,为14.50%,其原因可能是由于在掏取内脏过程中,肠道内容物溢出,鸡肉表面易被粪便等污染,并且在分割的长链条环境和人员操作下存在严重的交叉污染所致。石颖等的调查发现,市场鸡肉中沙门氏菌的污染率高达69.9%,高于本实验研究,说明环境卫生、从业人员的操作等都有可能造成肉品的污染,相关部门应加强卫生安全管理。近年来,由于疾病治疗及抗生素类饲料添加剂的大量使用,使沙门氏菌耐药性迅速传播,且其耐药性逐渐增强。本研究中沙门氏菌