基因紊乱对sz诱导的糖尿病小鼠肝、肾功能的影响

基因紊乱对sz诱导的糖尿病小鼠肝、肾功能的影响

节日是自然界最常见的自然现象。这是一个设置和调节水体温度和湿度的系统。这是一个带24小时的系统。研究表明,哺乳动物的生物钟包括中枢生物钟(母钟)和外周生物钟(子钟)。中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核(SCN),它可自主独立产生并维持日周期节律,由此发出的信息控制机体的行为和生理节律,包括运动、睡眠、体温和许多内分泌等全身的节律活动,SCN自身的节律性具有内在的遗传基础,同时又受到环境中光的影响(主要是夜光)发生反应,而许多非光因子并不影响SCN生物钟的基因表达。外周生物钟存在于除了SCN以外的多数组织,例如心脏、肝脏、肾脏等,但是其不能自主产生节律,而是由SCN生物钟控制下的各种神经、体液及其他信号因子直接或间接控制,从而调控效应器的节律。近年来有研究报道,生物钟与血糖调节密切相关。本实验拟通过改变糖尿病小鼠的光照节律,建立糖尿病小鼠的生物钟紊乱模型,从而观察生物钟紊乱对糖尿病小鼠肾脏、肝脏损伤的影响,并探讨其作用机制。1材料和方法1.1菌株及仪器清洁级雄性昆明种小鼠30只,体重20～25g(第四军医大学实验动物中心提供);链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司);罗氏血糖仪(德国罗氏公司);考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、血肌酐测定试剂盒、血尿素氮测定试剂盒、谷丙转氨酶测定试剂盒和谷草转氨酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。1.2血糖模型及基础设施模型建立随机将小鼠分为A、B、C组,分别是正常对照组、糖尿病组、生物钟紊乱的糖尿病组。参照文献方法,小鼠适应性喂养1周后建立STZ糖尿病模型。B、C组小鼠禁食不禁水12h后,按150mg/kg腹腔注射1次10g/LSTZ(STZ溶于pH4.4、0.1mmol/L冰冷的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液),A组注射等量的生理盐水。血糖稳定3d后,禁食不禁水12h后尾静脉取血,用罗式血糖仪测定空腹血糖(FBG),以FBG≥11.1mmol/L为糖尿病模型建立成功。糖尿病模型建立成功后,将C组小鼠置于12h黑暗/12h光照的条件下(黑暗07∶00～19∶00,光照19∶00～07∶00)2d;2d后再置于完全黑暗中饲养4d。A、B组任置于正常12h光照/12h黑暗(光照07∶00～19∶00,黑暗19∶00～07∶00)条件下。1.3样品的收集和检测1.3.1一般条件下的情况成模后测小鼠体重,同时观察其生长状况,观察有无“三多一少”(多尿、多饮、多食、体重减轻)的出现。1.3.2血糖浓度的测量禁食不禁水12h后,尾静脉取血,用罗式血糖仪测定各组小鼠FBG值。1.3.324小时尿蛋白测定在制作生物种模型后1d收集A、B、C组小鼠的尿液,记录24h尿量,用考马斯亮蓝法检测24h尿蛋白定量。1.3.4制备血清小鼠摘眼球取血,3000r/min离心10min,制备血清。应用生化试剂盒,测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血肌酐、血尿素氮。1.3.5肝、肾包膜的净化取血完毕后,立即剖腹取出小鼠肝脏、肾脏,以4℃氯化钠溶液洗净,小心剥去肝、肾包膜并称重。计算肾重系数=肾重/体重、肝重系数=肝重/体重,单位以mg/g计。1.4组24h尿蛋白定量间的比较所有数据均采用SPSS18.0软件进行处理,计量资料以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,3组24尿蛋白定量间的比较采用非参数秩和Kruskal-WallisH检验,余多组计量资料的比较采用单因素方差分析方法,多重比较采用LSD-t检验法。P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1体毛稀疏无光泽且人格异常A组小鼠反应正常灵敏,体毛平伏有光泽,B组小鼠在模型成功后逐渐出现多饮、多食、多尿、消瘦等症状,活动迟缓,精神萎靡,体毛稀疏竖起无光泽,实验过程中死亡1只。C组在成模后亦出现多饮、多食、多尿、消瘦等症状,但更为严重,活动明显迟缓,精神异常萎靡,体毛竖起无光泽,实验过程中死亡2只。2.2各组大鼠肾重系数和肝重系数的测定结果C、B组小鼠的肾重系数、肝重系数值均高于A组(P<0.01)。C组小鼠的肾重系数、肝重系数值高于B组(P<0.01,表1)。2.3各组小鼠的血胱素氮和血尿素氮的、比较C、B组小鼠的血糖均高于A组,且差异均具有统计学意义(P<0.01)。C组小鼠的血糖高于B组,且差异具有统计学意义(P<0.01)。C、B组小鼠的血肌酐均高于A组,且差异均具有统计学意义(P<0.01)。C组小鼠的血肌酐高于B组,且差异具有统计学意义(P<0.01)。C、B组小鼠的血尿素氮均高于A组,且差异均具有统计学意义(P<0.01)。C组小鼠的血尿素氮值高于B组,且差异具有统计学意义(P<0.01)。结果见表2。2.4小鼠所比较的24h尿蛋白定量测定h尿蛋白定量测定结果的比较测定结果经Kruskal-WallisH检验(H=17.105,Hc=17.105,查χ2界值表0.025<P<0.050),可以认为3组小鼠所比较的24h尿蛋白定量测定结果有显著差别(表3)。2.5比较两组不同的统计学意义C、B组小鼠的ALT、AST值均高于A组,且差异均具有统计学意义(P<0.01)。C组小鼠的ALT、AST值高于B组,且差异具有统计学意义(P<0.01,表3)。3血糖与脏器功能昼夜节律生物钟是机体内的定时体系,它使机体行为、生理呈现近似24h的节律,一旦正常生物钟被破坏即生物钟紊乱,就会导致各种心血管疾病、代谢性疾病、炎症以及癌症等的发生。最新的研究表明,生物钟与血糖调节密切相关,生物钟紊乱可加重高血糖和糖尿病。本实验通过改变糖尿病小鼠的光照条件模拟了糖尿病小鼠的生物钟紊乱模型,研究结果发现,C组的小鼠的FBG水平与B组相比较有统计学意义(P<0.01),提示生物钟紊乱明显提高了糖尿病小鼠的血糖水平,这与NABILA,TUREK的报道一致。NABILA等认为褪黑素可能介导机体的生物节律与体内血糖水平之间联系。EckhardMühlbauer等指出生物钟紊乱降低了褪黑素释放,而褪黑素与胰岛素的分泌量密切相关,从而影响了体内的血糖水平。WU等指出生物钟紊乱降低了褪黑素释放,褪黑素受体MT1亚型在下丘脑和垂体广泛存在,MT1受体亚型和CRH的共区域化提示褪黑素可能在下丘脑室旁核直接调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)活性。作者推测褪黑素具有抑制HPA轴功能,而生物钟紊乱时,褪黑素的释放减少,从而对下HPA轴抑制功能减弱。而在高血糖状态下,机体HPA轴功能本身就处于过度激活状态,再加上褪黑素对其的抑制作用减弱,其活性更强,从而使升糖作用加强,从而加重了高糖对机体的损害。作者观察了血糖水平对肝肾功能损害程度的影响,实验结果显示C组与B组、A组相比,B组与A组相比,小鼠的肾重系数、肝重系数均升高,且差异具有统计学意义(P<0.01)。肝、肾重系数是反映肝、肾功能损害的敏感指标,肝、肾重系数越大,肝、肾脏肥大程度越重,肝、肾损害的程度也越重。C组与B组、A组相比,B组与A组相比,小鼠的24h尿蛋白定量、血肌酐、血清中ALT、AST的含量均升高,且差异具有统计学意义(P<0.01)。这表明糖尿病小鼠肾脏、肝脏的损伤程度可能与FBG水平呈正相关。糖尿病时,体内慢性持续性的高血糖能够导致过高的糖化反应和氧化应激的形成,促进炎症发生、发展,从而导致各脏器的炎症反应;高血糖还能导致糖及脂质代谢的障碍,导致糖原生成增多,引起脏器的脂肪变性以及糖原、脂滴在脏器中的沉积;此外,高血糖还能促进肾脏、肝脏的纤维化。因此认为生物钟紊乱通过升高空腹血糖水平加重了糖尿病小鼠肾脏、肝脏结构的破坏,加速