几种因素组合对大鼠实验性糖尿病肾病模型建立的影响

几种因素组合对大鼠实验性糖尿病肾病模型建立的影响

糖尿病是一种慢性性内在疾病和代谢性疾病。该病严重，发病率高。它伴有着眼、肾、心、脑等各种器官的并发症。糖尿病肾病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病常见的慢性并发症之一,由糖尿病微血管病变引起。DN确切的发病机制至今尚未阐明,可能是多因素协同作用的结果,尤其是自由基的作用不容忽视。在糖尿病动物和细胞培养模型中越来越多的证据表明,自由基和有效的氧化剂过氧化亚硝酸盐(超氧阴离子基团和氧化亚氮的产物)的共同作用使血液流动代谢异常而导致DN。为阐明DN的发病机制,建立较为理想的DN动物模型显得尤为重要。目前,国内外所进行的糖尿病及其并发症实验动物研究多采用有糖尿病遗传倾向的近交系纯种动物,但是这些动物的来源少,饲养条件苛刻,并且其特点是遗传因素在发病过程中占主导地位,与临床上的2型糖尿病发病特征不完全吻合因此笔者采用高糖高脂饲料链脲佐菌素单肾切除、阿霉素等因素组合建立了DN动物模型,观察了这几种因素对模型建立中大鼠血脂、糖化血红蛋白(HBA1c)、肾功能及醛糖还原酶(AR)等指标的影响,确定了建立DN大鼠模型的最佳方案。1材料和方法1.1清洁级大鼠大鼠45d~50d龄的♂Sprague-Dawley清洁级大鼠,体重200g~250g;高糖高脂饲料:普通饲料∶白糖∶猪油∶鸡蛋=70∶9∶12∶9,均由第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。1.2超氧化物歧化酶及丙二醛试剂盒STZ(美国Calbiochem公司);阿霉素注射液(浙江海正药业股份有限公司);速眠新注射液(长春农牧大学兽医研究所);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程公司);NADPHNa2、NADPHNa4(美国Biosharp公司);DL-甘油醛(德国CarlRoth公司)。1.3全自动生化分析方法UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu公司);7150型全自动生化分析仪(日本Hitachi公司);960CRT型荧光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。1.4主要指标和实验方法1.4.1阿霉素给药A组为正常组,以普通饲料喂养;B为高糖高脂饲料组;C组为高糖高脂饲料+STZ组,以高糖高脂饲料喂养6wk后,腹腔注射STZ;D组为高糖高脂饲料+阿霉素+STZ组,以高糖高脂饲料喂养4wk后,腹腔注射阿霉素,2wk后注射STZ;E组为高糖高脂饲料+单肾切除+STZ组,以高糖高脂饲料喂养4wk后,单肾切除,2wk后注射STZ。单肾切除:大鼠实验前禁食12h,腹腔注射速眠新注射液1.0ml/kg(体重),麻醉后消毒腹部,沿腹中线切开皮肤及肌肉,手术缝线沿肾蒂结扎左肾血管,剪掉肾脏,手术针缝合,肌肉注射青霉素2万IU,单笼饲养,再肌肉注射青霉素2万IU,2次/d,连续1wk。阿霉素给药方法:大鼠实验前禁食12h,腹腔注射阿霉素4mg/kg(体重),1wk后再给予3.5mg/kg。STZ给药方法:大鼠实验前禁食12h,STZ临用前以0.1mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH4.6)配制成浓度为5%的溶液,按40mg/kg(体重)剂量腹腔内注射。1.4.2hba1c的检测大鼠造模后12wk禁食12h,腹腔注射速眠新注射液1.0ml/kg,心脏取血,分装于抗凝与促凝管中,测HBA1c、胰岛素、血肌酐(CREA)、尿肌酐、尿素(UREA)、胆固醇(CH)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、肾小球滤过率(GFR)等。HBA1c测定采用免疫比浊法,胰岛素测定采用电化学发光法,ALB测定采用溴甲酚绿法,其余生化指标测定采用酶法。1.4.3dl-甘油醛/nadph检测(1)NADPH标准曲线的绘制。准确称取5mgNADPH置于10ml容量瓶中,加双蒸水至刻度,分别稀释得到浓度为0.06、0.6、6.0、12、18μmol/L的溶液,于367nm/455nm波长处检测荧光强度(AR标准曲线:Y=0.04588+0.04532X,r=0.9985,其中Y为荧光强度,X为浓度)。(2)取血样1ml,加肝素抗凝管,离心(1500g)10min,红细胞用10倍体积的等渗盐水冲洗3次,加4倍体积10mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH6.0)振荡10min,使之完全溶血,溶血液离心(10000g)30min以除去细胞有形成分。(3)最终测定浓度的配制。加入67mmol/L的钠-钾磷酸缓冲液(pH7.0),0.2mol/L磷酸胺,0.1mmol/LNADPH,10mmol/LDL—甘油醛和红细胞溶血液10μl,总体积1.0ml,空白管以双蒸水代替DL-甘油醛。(4)在37℃水浴中加热反应5min,加入0.3mol/LNaOH2ml终止反应。充分混匀后,60℃下加热15min,破坏NADP+,然后加入11.8mol/LNaOH(内含0.01%H2O2)3.0ml充分混匀,经37℃下保温60min后,在367nm/455nm波长处测定相对荧光强度,从NADPH荧光测定工作曲线上读出NADPH。1IU酶活性表示1min内1μmolNADPH被氧化的酶量,每份标本的AR活性用IU/gHb表示。1.4.4sed和mda的测量1.5统计方法实验结果以表示,采用方差分析比较,组间差异采用q检验,以P<0.05作为差异具有显著性的标准,采用SPSS13.0软件进行分析。2各组大鼠尿胱被调指标表1因D组大鼠存活率太低,故以下结果中无该组数据。各组各指标测定结果详见表1(其中GFR=尿肌酐×每分钟尿量/血肌酐)。由表1可见,HBA1c以E组最高,C组与E组、A组与B组之间无显著性差异,A、B组与C、E组有显著性差异;ALB以B组最高,B组与A、C、E组之间有显著性差异,C组与E组间无显著性差异;CH以C组最高,C组与E组无显著性差异,A组与B、C、E组间有显著性差异,B组与C、E组间有显著性差异;TG以E组最高,A组与B、C、E组有显著性差异,B组与C、E组有显著性差异,C组与E组有显著性差异;尿肌酐B、C、E组与A组比较有显著性差异;UREA以E组最高,A组与B组无显著性差异,与C、E组有显著性差异,B组与C、E组有差异,C组与E组有显著性差异;CREAA组与B、C组无显著性差异,与E组有显著性差异,B组与C组无显著性差异,与E组有显著性差异,C组与E组有显著性差异;GFR以E组最高,A组与B组无显著性差异,与C、E组有显著性差异,B组与C、E组有显著性差异,C组与E组有显著性差异。上述结果表明,高糖高脂饲料+单肾切除+STZ即E组对HBA1c、血脂、肾功能(包括GFR)的影响是最为显著的,单纯高糖高脂饲料对上述指标的影响不显著。2.2各组sod、b、e组建模后胰岛素的变化各组大鼠MDA、SOD及胰岛素的测定结果详见表2。由表2可见,B、C、E组建模后MDA升高,与A组比较有显著性差异,B组与C、E组有显著性差异,C组与E组无显著性差异;B、C、E组建模后SOD降低,与A组比较有显著性差异;B、C、E组建模后胰岛素升高,以E组值最高,与A组比较有显著性差异,B组与C、E组间比较有显著性差异;B、C、E组建模后升高以组升高最显著与组比较有显著性差异,B组与C组无显著性差异,与E组有显著性差异。综上所述,E组建模后对MDA、SOD、胰岛素和AR的影响最为显著,其次为C组。3阿霉素的毒副反应对于糖尿病及其并发症的动物模型的建立方法有多种,传统类似2型糖尿病的建模采用小剂量注射STZ配合高糖高脂饲料的方法进行。应用高糖高脂饲料的目的就是抑制葡萄糖向6-磷酸葡萄糖的分解转化而加重糖代谢的紊乱,其中血脂升高是此类模型的特征,与临床2型糖尿病比较符合。胰岛素抵抗发生后,只要胰腺能维持足够高的胰岛素分泌来克服胰岛素抵抗,那么糖耐量将保持正常或轻度受损,而注射STZ后β细胞功能开始衰竭,糖耐量将迅速恶化。大鼠注射阿霉素后,不仅有氨基苷类抗菌药物的肾毒性作用,而且还产生具极强氧化作用的自由基,造成微小肾脏病变模型。笔者在研究中发现,由于阿霉素毒性太大,加上STZ对胰岛β细胞功能的破坏,大鼠存活率低,不能作为常规的建模方法。而单肾切除后导致对侧肾代偿性增生,加速DN的形成,可节省造模和实验时间。无论是临床研究还是动物实验均发现,在糖尿病情况下常伴有活性氧产生增多或存在着抗氧化酶系统SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)等的功能降低,致使肾组织中局部活性氧生成和清除之间的平衡被打破。SOD是体内歧化超氧阴离子自由基的抗氧化酶,血清的SOD水平可以反应体内对自由基的中和及清除能力。MDA是最常见的脂质过氧化产物,MDA的量可以衡量脂质过氧化的程度,间接反映脂质氧化所产生的活性氧水平。氧自由基代谢紊乱常发生在肾脏形态学改变之前的糖尿病早期氧自由基可能是通过损伤基底膜和血管内皮细胞膜,也可能参与了糖尿病早期的肾小球血流动力学的变化过程,最终导致肾功能障碍。本实验采用了几种因素交叉组合建摸,并从血糖、尿微量ALB的渐进性变化等方面进行了观察,结果发现:(1)单用高糖高脂饲料喂养可以使大鼠血脂升高。(2)高糖高脂饲料加用小剂量注射STZ可以显著升高血脂,GFR、HBA1c、MDA、S