不同培养基及外植体对土木愈伤组织生长的影响

不同培养基及外植体对土木愈伤组织生长的影响

楠木树是一棵具有超大背景的热带树，结构致密，材料坚硬，无变形和开裂，质地笔直，质地光滑，耐腐蚀性和抗虫性。广泛应用于家具、雕塑等生产材料。这是世界上著名的材料树种。目前,国内外的柚木的组培快繁技术已经非常成熟,而且我国的柚木快繁技术现已完全达到了工厂化育苗的要求,但我国引种的柚木在栽培上还面临着树木最初开花期过早(影响主干高度生长),土壤酸性、低温冻害、病虫害等问题的困扰,利用植物基因工程对延迟其最初开花时间、改良柚木材性、增强抗逆性等优良性状是一个行之有效的途径,而愈伤组织诱导是实现这一途径的基础。有关柚木愈伤组织诱导及再生的研究报道较少,而且基本为国外的研究报道,我国在此方面的研究较迟,尤其是针对性地进行柚木愈伤组织诱导的相关研究尚未有报道。作者借鉴前人的研究成果,通过对基本培养基的筛选和对培养条件的优化试验,旨在筛选出柚木愈伤组织生长较好的培养基及培养条件,为柚木的再生体系建立、遗传转化等生物技术的研究奠定初步的基础。1材料和方法1.1组培瓶苗的选择供试材料为中国林科院热带林业研究所选育的柚木优良无性系7114无菌苗,该无性系选自海南尖峰岭柚木种源试验的优良单株,是经初代及继代培养后的组培瓶苗。1.2生长调节剂的选择及其对茎段“不带来源”愈伤组织生长的影响培养基及外植体筛选试验采用MS,1/2MS,WPM培养基,以叶片、带节间的茎段、不带节间的茎段、茎尖(即无菌苗顶芽)为外植体。不同光照条件(暗培养7、14、21、28d,并以一直暗培养为对照,共5个处理)、培养方式(滤纸桥液体培养和固体培养)以及培养时间(5、10、15、20、25、30、35d)对茎段(不带节间)愈伤组织生长影响的试验采用MS培养基。以上试验均加入1.0mg·L-16-BA和0.5mg·L-1NAA。在MS基本培养基上进行生长调节剂NAA(0.5、1、2mg·L-1)和6-BA(0、0.5、1、1.5、2、3、4mg·L-1)组合的双因素完全随机试验设计,研究NAA与6-BA两种激素对茎段(不带节间)愈伤组织生长的影响试验。培养基中均加入蔗糖30g·L-1,用琼脂7g·L-1固化,pH在高压灭菌前调至5.8。上述实验每个处理接种外植体30个,重复3次。1.3愈伤组织观察培养室温度(25±2)℃,每日光照时数10h,光照强度1800~2000lx(暗培养除外),观察4~6周后,统计愈伤组织发生情况。所有百分率数据在进行方差分析前经反正弦变换,采用SPSS14.0软件对数据进行方差分析和最小显著差异性检验(LSD法,P<0.05)。2结果与分析2.1ms培养基的诱导愈伤组织方差分析结果(见表1)表明,外植体间柚木愈伤诱导率差异极显著(P<0.01),其中不带节间的茎段、叶片最好,诱导率均达到70%以上,它们与带节间茎段和茎尖的诱导率相比差异显著和极显著。3种基本培养基以及培养基与外植体的交互作用对愈伤组织诱导影响达到显著水平,多重比较表明MS基本培养基要好于1/2MS、WPM基本培养基。外植体接入培养基后10d左右首先在切口处开始萌动,产生愈伤的质地、状态以MS培养基最好。MS培养基产生的愈伤基本呈黄色到乳黄色、为致密的,颗粒状的愈伤组织。1/2MS培养基诱导的愈伤为乳黄色,呈水渍状,不适宜进一步的继代培养。WPM培养基上诱导的愈伤茎段(不带节间)为乳白色到灰白色,质地疏松,易碎,无光泽,带节间茎段及叶片的愈伤长的较慢呈黄色致密状。茎尖在此处理条件下只有在MS培养基中才会诱导产生愈伤(见图1),说明了MS培养基适宜不同外植体的愈伤组织诱导。观察还发现,在MS培养基中一般带节间的茎段产生的愈伤基本是在腋芽萌发后产生较大的愈伤(平均直径9mm),若腋芽未萌发则或者不产生愈伤或者愈伤很小(平均直径2mm)。WPM培养基中培养的带节间的茎段的腋芽长的很小,这也是在进行柚木快繁时采用MS为基本培养基的原因。由图1可知MS培养基中外植体不带节间的茎段的诱导率最高,达到74.47%,其次是叶片、带节间的茎段和茎尖,诱导率分别为74.24%、45.45%和33.33%。叶片诱导的愈伤在后期的继代培养中发现其较易褐化,茎段(不带节间)愈伤的生活力相对较旺盛,适合用来进行继代培养。权衡愈伤组织的诱导率及其生长情况,使用MS培养基较合适,外植体采用不带节间的茎段较好。2.2暗培养对愈伤组织的诱导分别暗培养7、14、21、28d后,再进行光培养,以暗培养为对照,共5种不同的光照处理模式,30d后愈伤组织的出愈率结果表明,暗培养28d后转为光培养的处理愈伤组织的诱导率显著高于其它4种处理(P<0.05)(见表2),说明暗培养对柚木茎段(不带节间)愈伤组织诱导有很大的影响。适宜的暗处理有利于茎段(不带节间)愈伤的生长,同时实验也发现暗培养1~2周后将外植体放于光下培养产生的愈伤虽然颜色、质地差异不大,但产生的愈伤大小要远远小于暗培养3~4周后的愈伤,且生长状况也不如后者。始终暗培养的愈伤组织诱导率低于暗培养28d后再光照的处理,说明适当的光培养对柚木茎段(不带节间)愈伤的诱导也有一定的促进作用,光暗交替培养可以有效提高愈伤的诱导率。2.3滤纸桥液体诱导在MS培养基上分别设置滤纸桥液体培养和固体培养两种方式诱导茎段(不带节间)愈伤。由表3可看出采用滤纸桥液体诱导的方式愈伤诱导率要好于固体培养基,愈伤为绿色,有光泽,致密;固体培养基产生浅黄色或黄绿色、致密的愈伤组织,但前者愈伤需要15d左右时间才有愈伤产生,固体培养基7d左右便可见,总体认为滤纸桥液体培养方式好于固体培养方式,有利于愈伤的诱导。2.4-ba和naa对愈伤组织的诱导试验选择NAA和6-BA的组合为激素配比,以MS为基本培养基,添加30g·L-1蔗糖、7g·L-1琼脂,接入7mm长的无菌幼苗茎段(不带节间)。35d后统计外植体诱导出的愈伤组织的平均直径及其诱导率。从表4中可以发现单独添加生长素NAA(浓度0.5~2mg·L-1)不能诱导茎段(不带节间)产生愈伤组织,外植体只是肿胀,有些会长出白色透明的须根。当6-BA与NAA共同作用后会诱导愈伤组织产生。试验中还发现会产生两种类型愈伤,一种为致密型的;一种为疏松易碎型。当6-BA质量浓度低于2mg·L-1时诱导产生颜色为浅黄到黄色的致密的愈伤,高于或等于2mg·L-1时产生黄色到黄绿色的疏松易碎的愈伤组织,并且前种愈伤诱导率较低,在本试验的浓度范围内产生致密的愈伤以1mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA组合诱导率最高,平均直径大小随着NAA浓度的增大呈逐渐减小的趋势。对于第二种疏松型的愈伤组织诱导率基本都能够达到50%以上,这种愈伤适用于进行液体悬浮继代培养,6-BA与NAA浓度比在1~1.5mg·L-1有利于愈伤组织的生长,此类愈伤以2mg·L-16-BA+2mg·L-1NAA为最好的激素组合。方差分析结果显示(见表5),两种激素以及其交互作用对柚木幼苗茎段(不带节间)愈伤组织诱导率及愈伤直径大小均达到了显著差异(p<0.05)。综合考虑认为NAA浓度选择0.5mg·L-1,1mg·L-1较好,6-BA浓度选择1~3mg·L-1较适宜,浓度过高过低均不利于愈伤的诱导及生长。2.5生长平稳期对不同培养天数的柚木愈伤组织鲜重建立了柚木愈伤组织生长曲线,从图2可以看出柚木愈伤组织的生长曲线大致呈S形。愈伤生长萌动期较长,接种后的前20d生长曲线较为平滑,这段期间可以看到切口处产生很少浅黄色透明的愈伤组织,20d后进入对数生长期,在20~30d期间,愈伤组织生长速度明显加快,可以看到愈伤组织长满整个外植体,且28d后将培养基转移到光下培养,愈伤组织生长快速加快与此期间的光照培养应该也有很大关系。30~35d愈伤生长变缓,处于生长平稳期。所以可以认为柚木愈伤组织最适继代时间为30~35d,这一研究与陈荣、李琰等人对愈伤组织生长的研究相似。3-ba与naa、2,4-d的激素对愈伤组织的诱导效果植物愈伤组织的诱导主要受外植体本身、培养基和培养环境三大因素的调控。一般认为,高盐的基本培养基较适合愈伤组织的生长,在本试验中高盐的MS培养基适合柚木愈伤组织生长,中盐的1/2MS和WPM虽也可以诱导产生愈伤,但愈伤或水渍化或无光泽,生活力不强,不适宜茎段(不带节间)愈伤组织的诱导。Baghel等在对不同基本培养基的选择试验中也采用MS培养基用于愈伤诱导以及再生全过程,他们在试验中发现外植体在MS培养基中愈伤生长的综合反应好于其它培养基。Kushalkar等也采用MS培养基应用于柚木体细胞胚胎发生的研究。当然也有学者认为1/2MS,WPM培养基为柚木愈伤诱导较适的培养基,这有可能是因为外植体不同,或者使用的激素种类不同导致对不同基本培养基的反应不同,所产生的愈伤质地不同。本试验中以6-BA和NAA两种激素共同处理的情况下,MS培养基诱导的愈伤质地,颜色均好于另外两种基本培养基,因此,认为MS培养基为最适的基本培养基。由于植物组织或细胞在离体培养条件下往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力,为了使细胞生长、分化和分裂,在多数情况下需要生长素和细胞分裂素两种生长调节剂的作用,而且很多研究表明生长素和细胞分裂素配合使用时效果更好。Rosilah在对柚木愈伤组织诱导的试验中研究也证明6-BA与NAA这两种激素共同作用有利于愈伤的诱导。Baghel等采用子叶、上胚轴等部位做为外植体时发现单独添加生长素NAA、2,4-D都可以诱导愈伤的产生。笔者在前期预试验过程中曾采用叶片为外植体,单独添加生长素NAA(0.5mg·L-1)进行诱导,也可以产生愈伤,而本试验采用茎段(不带节间)为外植体,在只含有NAA(0.5~2mg·L-1)的培养基上,愈伤组织的诱导率为零,当和一定浓度的6-BA配合使用时,愈伤组织的诱导率大大提高,产生的愈伤组织较多且质量好,而且有利于愈伤组织的增殖,这种现象说明柚木的不同外植体内部的激素含量水平不同,促使激素对外植体的愈伤诱导效果存在差异,即由于外植体或基因型不同,导致各自的生理状态和所处的生育时期不同,其内源激素浓度和比例不同,以至于出现不同植物的器官和组织,其形态发生能力大不相同,或者即使同种植物不同部分做外植体时,所需要的营养和植物激素的用量也不相同。本试验中产生两种类型的愈伤组织(图3),方差分析表明与6-BA的浓度有关,当6-BA处于低浓度状态下(小于2mg·L-1)产生致密的愈伤组织,高浓度下(大于或等于2mg·L-1)产生疏松的愈伤。细胞分裂素的主要生理作用是促进细胞的分裂和扩大,诱导芽的分化,促进侧芽的萌发生长,抑制衰老;而生长素主要是促进细胞伸长生长和细胞分裂,诱导受伤的组织表面一至数层细胞恢复分裂能力,形成愈伤组织,诱导生根。本试验中单独添加生长素NAA(浓度为1~2mg·L-1时),茎段(不带节间)外植体有须根产生就是由于生长素有促进生根这一作用的原因。Baghel等采用不同的激素处理产生了不同状态、质地、颜色的愈伤,有致密的,疏松的易碎的;表面干燥的,水渍状的;颜色有白色的、深绿或浅绿、黄色的。许耀祖等在研究薰衣草愈伤诱导情况也发现采用同样两种激素处理会产生两种不同类型的愈伤组织,这些都证明了不同外植体、不同的激素类型以及激素比例产生的愈伤类型也会存在很大差异。本试验中两种愈伤组织都不易褐化,有生活力,适于进行再生分化诱导的愈伤组织因植物种类、外植体等因素不同既有较致密型的又有疏松易碎型的,其中前者适合用于固体培养,后者为进行液体悬浮培养较适愈伤组织。Widiyanto等将产生的浅黄色致密的愈伤组织进行分化培养,最终诱导产生了再生植株。Rosilah等将产生的白色易碎的愈伤进行液体悬浮培养,愈伤产生了胚状体的初期结构(近心型胚)。根据愈伤质地、诱导率及平均直径大小三项指标认为本试验中激素浓度组合MS+0.5mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA及MS+2mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA为于愈伤组织的诱导及生长最适培养基。在愈伤组织诱导阶段,一般采用全暗、周期性光照、散射性光照三种形式。愈伤组织的诱导一般需弱光或不需光,而愈伤组织生长往往需要光照。根据愈伤组织生长曲线也可知培养到第3周后愈伤开始大量生长,而不同暗培养处理中,暗培养两周后将外植体转移到光下培养愈伤诱导率不高,而且长势也不如之后的处理,说明愈伤诱导前期需要3周左右的暗培养时间,然后愈伤进入分裂期,开始迅速生长,这时候进行光培养可以促进愈伤的生长。如果仅进行光培养或暗培养诱导率均为75%左右,但本试验先暗培养28d然后进