苦荞麦黄酮对糖尿病大鼠神经功能的影响

苦荞麦黄酮对糖尿病大鼠神经功能的影响

苦荞麦（l.）是蓼科的一种植物。根据现代本草纲目，苦荞麦具有苦、平、寒、益气、连续精神、益眼、理气、宽肠、健胃的作用。现代临床医学观察表明,苦荞麦籽粒、根、茎、叶及花中均含有较多的槲皮素、芦丁、山奈酚-3-芸香糖甙和槲皮素-3-葡萄糖芸香糖甙等黄酮类化合物。苦荞麦粉及其制品具有降血糖、降血脂,抗氧化和清除自由基等多种生理活性。对糖尿病、高血压、高血脂、冠心病等病都有较好治疗作用。而这些活性可能与其改善神经功能有关,笔者拟探讨苦荞麦黄酮对糖尿病模型动物神经功能的影响。1材料表面1.1测试对象苦荞麦黄酮(由沈阳药科大学提供,批号:20000518),用蒸馏水溶解供试;地塞米松注射液(沈阳第一制药厂,批号:030821)。1.2动物照明照明选择180~220g的Wistar大鼠,7~8周,雌雄各半,由沈阳药科大学实验动物中心提供。随机分组后置于温度18~29℃,相对湿度50%~70%,40W日光灯照明,每日早8时到晚8时光照,每5只大鼠一笼群养,动物自由摄食,饮水。适应上述环境一周后用于实验。1.3试剂和试剂盒导升明(Doxium,由奥地利依比威公司提供),链脲佐菌素(Streptozotocin,Sigma.ChemicalCo.美国Lot100K1677),哇巴因(SigmaChemicalCo.Lot30K1207),腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐(中国科学院上海神经化学研究所,批号:8903067),戊巴比妥钠(上海行知化工厂,批号:921019),吡啶(由沈阳化学试剂厂提供),无水乙醇(沈阳第一试剂厂,批号:2000022301),ADP(上海生物化学研究所,批号:20000818),ATP酶试剂盒(南京建成生物研究所,批号:20040315),LA试剂盒(南京建成生物研究所,批号:20040423),CK试剂盒(南京建成生物研究所,批号:20040423),水合氯醛(中国医药集团上海化学试剂公司,批号:20030227),三氯醋酸(沈阳化学试剂厂,批号:20000712),氯化钠(沈阳化学试剂厂,批号:200309011),盐酸(沈阳化学试剂厂,批号:200311011),正丁醇(天津市博迪化工有限公司,批号:031203),DNTB(Fluka化学试剂公司提供,批号:023K3744),磷酸二氢钾(汕头市金砂化工厂生产,批号:930505),磷酸氢二钾(沈阳市试剂一厂,批号:930505),血糖试剂盒(保定长城临床试剂公司,批号:20031005)。1.4仪器、试剂和仪器721分光光度计(山东高密分析仪器厂),PcLab生物信号采集处理系统(北京微信斯达有限公司提供),PF3多普勒血流仪(瑞典PerimedPerifluxCo.IMX),自动免疫分析仪(美国雅培公司),FA·JA系列电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司),TGL-16C台式高速离心机(江苏环保仪器厂),YKH-Ⅱ液体快速混合器(江西医疗器械厂),H.H.S21-4电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂),TN-100B型托盘式扭力天平(上海第二天平仪器厂)。2方法2.1分组及给药情况观察取大鼠,测定其血糖。从雌性大鼠中随机取出5只,雄性大鼠中随机取出5只作为正常对照,其余动物禁食12h后,腹腔注射(ip)STZ生理盐水溶液65mg/kg(无菌生理盐水临用时现配),给药体积为1mL/100g,造糖尿病模型。给予链脲佐菌素后24h内,动物饮用葡萄糖水,然后自由摄食饮水,72h后测定大鼠空腹血糖,血糖大于16mmol/L的动物入选。选出大鼠50只参加实验,测定大鼠血糖。并按大鼠血糖和体重随机分组,分组及处理情况见表1。连续给药3个月,给药期间,观察动物的体重、摄食、饮水的变化及排泄等情况。给药结束时,测定各组大鼠血糖、神经血流量、脑GSH及Na+-K+-ATP酶的含量。2.2分光光度计划法大鼠眼眶静脉丛取血,离心分离血清。测定时吸取血清10μL,加入葡萄糖氧化酶酚混合试剂1.5mL,混匀后置37℃水浴保温15min,用分光光度计在505nm处比色。同时,取蒸馏水和标准葡萄糖溶液作对照,与样品平行实验,用空白管调零,分别读取各管光密度。样品管吸光度与葡萄糖标准溶液吸光度比较,计算样品中葡萄糖含量[血糖(mmol/L)=(样品管吸光度·标准管吸光度)×5.55]。2.3坐骨神经干内的血流量测定用35mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠,分离左腿坐骨神经,将神经嵌入塑料凹槽中,在月国窝上1cm处,用多普勒血流仪测定暴露的坐骨神经干内的血流量。连续记录10次血流量的变化,取其平均值作为该大鼠的神经血流量数值。2.4dntb试液的制备将大鼠断头处死,取脑0.2g在冰浴中,以0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)和0.8mL的10%三氯乙酸制成10%匀浆,室温下4000rpm离心15min,分离上清液0.5mL,加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)4.5mL稀释,加入0.4g/L的DNTB试液0.02mL,混匀。以不加脑匀浆的对照管调零,5min后,用721分光光度计412nm波长处比色,吸光度值除以脑重得出每克脑组织的谷胱甘肽含量。2.5u3000定型剂将大鼠断头处死,取脑,以0.2mmol/L蔗糖及0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)制成匀浆,直接用粗制匀浆加入酶反应管中。反应液中各化合物的浓度为:NaCl(100mmol/L),MgCl2(2.5mmol/L),KCl(10mmol/L),EDTA(2.0mmol/L),ATPNa2(1.0mmol/L)或哇巴因(0.2mmol/L)。37℃水浴中反应30min后速加无机磷显色剂2.5mL(含0.02%孔雀绿、0.55%钼酸铵及0.1%吐温20),再加2.4%柠檬酸钠0.2mL,室温反应30min,721分光光度计660nm波长处测定吸光度,计算无机磷含量,Na+-K+-ATP酶活性为不含哇巴因与含哇巴因两管之差值,除以脑重得出每克脑组织所含的Na+-K+-ATP酶活力单位。2.6神经扰动测试应用Pclab生物信号采集系统,显示模式为记忆示波,采样间隔为25μs,选择1、2、4采样通道,刺激器触发。第1、2通道连接输入电极,设置为原通带,刺激电极连接“刺激输出”插口,输出位置处于AC(交流电)状态。将大鼠用0.35%戊巴比妥钠麻醉后固定,在接近尾根部处安置一对刺激电极,并在尾部远心端和近心端各安置一对输入电极,测量两对输入电极之间的距离,采用Pclab生物信号采集处理系统给刺激电极施加一电刺激信号(电压1V,波宽0.1ms),1、2通道可记录神经干动作电位波形,4通道可记录刺激波形,由此可计算神经冲动从近心端电极传到远心端电极所需的时间。重复电刺激3次,每次间隔1min,取平均值,按下式计算其传导速度:传导速度(m/s)=电极距离(cm)×10−2传导时间(ms)×10−3(m/s)=电极距离(cm)×10-2传导时间(ms)×10-33结果3.1苦荞麦黄酮对糖尿病大鼠血糖的影响实验表明,链脲佐菌素造型后,大鼠血糖明显升高,与正常动物的血糖水平比较有显著差异。苦荞麦黄酮以40~80mg/kg剂量给动物灌胃,糖尿病动物的血糖在苦荞麦黄酮组显著下降,和模型组比较,血糖分别降低11%、15%,苦荞麦黄酮给予的各组动物血糖进行给药前后比较,均有显著差异,苦荞麦黄酮各组动物血糖的前后比较,分别降低11%、21%和25%,提示苦荞麦黄酮对高血糖动物的血糖具有调节作用。见表2。3.2苦荞麦黄酮对大鼠尾神经传导的影响链脲佐菌素造型后,大鼠尾运动神经传导速度较正常对照组显著降低,苦荞麦黄酮以20~80mg/kg剂量给动物灌胃,糖尿病动物的尾神经传导速度显著提高,甚至恢复到接近正常动物水平。见表3。3.3苦荞麦黄酮对大鼠gsh的影响链脲佐菌素糖尿病大鼠末次给药后次日,取大鼠端脑测定各组大鼠谷胱甘肽(GSH)含量。实验结果表明,糖尿病模型大鼠GSH含量明显减少,苦荞麦黄酮80、40、20mg/kg3个剂量均可显著增加糖尿病大鼠GSH含量,且呈一定的剂量反应关系(结果见表4)。导升明亦可阻止GSH的降低。3.4糖尿病大鼠na+-k+-atp酶活力变化链脲佐菌素糖尿病大鼠末次给药后次日,取大鼠右侧皮质测定Na+-K+-ATP酶含量。实验结果表明:糖尿病模型大鼠Na+-K+-ATP酶含量明显减少,苦荞麦黄酮80、40、20mg/kg。三个剂量均可显著增加糖尿病大鼠Na+-K+-ATP酶活力,且呈一定的剂量反应关系。导升明亦可抑制Na+-K+-ATP酶的降低(结果见表5)。3.5神经血流量的检测链脲佐菌素选择性破坏胰岛β细胞,导致血糖升高,进而,引起细胞内山梨醇升高,导致细胞内蛋白糖基化,许多酶的结构和功能出现改变,这种情况发生在血管壁,将导致血管上皮细胞坏死,基底膜增厚,导致组织细胞供血供氧障碍。链脲佐菌素造成糖尿病后,神经组织的供血减少,用多普勒血流仪测定坐骨神经干内的血流量,记录瞬时血流量的变化,取其平均值作为每只动物的血流量数据,再经统计处理计算神经血流量。测定结果表明:链脲佐菌素糖尿病模型大鼠坐骨神经血流量明显减少,苦荞麦黄酮80、40、20mg/kg三个剂量均可显著增加神经血流量,高剂量组甚至达到正常大鼠水平(见表6)。4苦荞黄酮对sh、na+-k+-atp酶活性的影响本实验通过建立糖尿病动物模型,观察模型动物血糖升高、神经传导速度下降,细胞代谢发生变化。苦荞麦黄酮能