5-fu胃癌多药耐药细胞株的建立及凋亡相关蛋白的表达

5-fu胃癌多药耐药细胞株的建立及凋亡相关蛋白的表达

对幽门肿瘤的药物类抗剂的抗剂已成为失败的重要原因之一。结果表明，肿瘤细胞对化疗药物的耐受性与多种因素有关，死亡抑制在肿瘤细胞药物的形成中起着重要作用。为了研究胃癌耐药机制,本研究以临床最常用的胃癌化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)诱导低分化胃腺癌细胞株BGC823建立起胃癌多药耐药细胞株BGC823/5-FU,并以此为模型,检测凋亡相关蛋白生存素(Survivin)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达变化,探讨胃癌细胞对5-FU耐药的机制。材料和方法1试剂和仪器RPMI-1640培养液购自Gibco;新生小牛血清购自杭州四季青公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma。Survivin、Bcl-2、Bax、caspase-3抗体购自SantaCruz。5-FU购自天津金辉氨基酸有限公司;阿霉素(ADM)购自浙江海正药业股份有限公司;丝裂霉素C(MMC)购自KyowaHakkoKogyo;顺铂(DDP)购自山东齐鲁制药厂;其它试剂均为国产分析纯。流式细胞仪(FACScan,BD),酶标仪(Model850,Bio-Rad)。2方法和步骤2.1耐药细胞培养人胃低分化腺癌细胞株BGC823购自中国医学科学院细胞库,本实验室传代保存。BGC823细胞于含青霉素100U/L、链霉素100mg/L,10%新生牛血清RPMI-l640完全培养液中置37℃、5%CO2、全湿度细胞培养箱内培养。采用反复大剂量冲击结合逐步递增药物浓度法,取对数生长期的BGC823细胞,加入5mg/L5-FU,于37℃、5%CO2、全湿度培养箱内孵育24h,用不含Ca2+、P3-的磷酸盐缓冲液D-Hanks洗1次,将细胞培养于无药RPMI-1640完全培养液中,待细胞恢复生长后,反复用5-FU冲击处理,同时逐渐增加药物浓度,经过8次冲击至5-FU药物浓度达40mg/L,建立其耐药细胞株BGC823/5-FU。待细胞恢复生长后将其维持培养于含5-FU10mg/L的RPMI-1640完全培养液中,每2-3d传代1次。撤药2周后进行细胞实验。2.2耐药计数测定收集对数生长期的BGC823及BGC823/5-FU细胞,调整细胞浓度至2×108cells/L。将细胞随机分为实验组、对照组与空白组,每组设3个平行孔。取实验组细胞悬液接种于96孔板内,100μL/well,孵育24h后再分别加入8个倍比稀释浓度梯度的5-FU、ADM、MMC和DDP,调整每孔终体积至200μL;以不加化疗药物组作为对照组;仅加入200μLRPMI-1640完全培养液为空白组。96孔培养板于细胞培养箱内孵育72h后,每孔加入MTT(5g/L)20μL,继续孵育4h后,2000r/min离心10min,弃上清。每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO),酶标仪上以570nm波长测定各孔吸光度(A)值。取3个平行孔的平均A值计算细胞生存率。细胞生存率(%)=(实验组A平均值/对照组A平均值)×100%;以药物浓度对数为横轴,生存率为纵轴,做出量-效曲线,求得半数抑制率(IC50),计算耐药倍数。耐药倍数RF=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。2.3p-gp抗体法取对数生长期的耐药细胞BGC823/5-FU和其亲本细胞BGC823,PBS洗净后分别加人FITC标记的P-gp抗体40μL,混匀,避光,4℃孵育30min。PBS终止反应,离心1000r/min,4℃离心5min,弃上清,PBS洗2次。流式细胞仪采用488nm激发波长,检测FITC荧光强度,Cell-quest软件进行分析。2.4dnr组的体外反应取对数生长期的耐药细胞BGC823/5-FU和其亲本细胞BGC823,加入含DNR2mg/L的培养液约3mL,另设不加DNR组作为对照组。分别于37℃孵育60min后,弃去培养液,胰蛋白酶消化30s,加入预冷的PBS约2mL中止反应。4℃1000r/min离心5min,弃上清液,用流式细胞仪进行检测。流式细胞仪激发波长为495nm,发射波长为590nm处检测细胞内DNR的自发荧光强度,Cell-quest软件进行分析。2.5蛋白质提取与凝胶电泳收集对数生长期的BGC823及BGC823/5-FU细胞,细胞裂解液(50mmol/LTris·ClpH6.8、100mmol/L二硫苏糖醇、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油)裂解细胞提取蛋白质,Bradford法进行蛋白定量,每孔上样蛋白量20μg,上样容量40μL,进行SDS凝胶电泳。180mA转膜120min后,用封闭液封闭硝酸纤维素膜,室温下振荡1h,以相应抗体进行杂交,ECL化学发光系统进行显色,X光片压片后显影、定影。利用Investigator-HTPCAnalyzer软件观察分析结果,QuantityOne吸光度分析软件对结果进行分析。3统计处理数据采用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,应用t检验进行统计学分析,检验水准α=0.05。结果1细胞的耐药性MTT法检测BGC823/5-FU细胞相对于BGC823细胞的耐药倍数为10.82倍,此细胞对各类临床常用化疗代表药物ADM(蒽环类)、MMC(抗生素类)和DDP(铂类)也分别具有2.5、22.23、2.0倍的耐药性,见表1。2u细胞p-gp表达水平流式细胞仪检测结果表明,BGC823/5-FU细胞P-gp表达水平为(71.52±1.60)%,显著高于其亲本细胞BGC823细胞(5.90±0.89)%,P<0.01,见图1。3各组bcg2c23/5-sf细胞内柔激素表达水平比较流式细胞仪检测结果表明,以不加DNR的亲本细胞BGC823即阴性对照组为2.57±0.11,BGC823/5-FU细胞内柔红霉素浓度为52.54±1.20,明显低于BGC823细胞209.19±4.92,P<0.01,见图2。4westernb生长量检测BGC823/5-FU细胞与BGC823细胞Survivin、Bcl-2、Bax、caspase-3的Westernblotting检测结果见图3与表2(内参照为β-Tubulin)。与BGC823细胞相比,BGC823/5-FU细胞Survivin表达上升(P<0.05);Bcl-2表达升高(P<0.05);Bax表达下降(P<0.05);caspase-3表达减低(P<0.05)。抗凋亡活性化合物在体外建立肿瘤耐药细胞系是研究肿瘤耐药的良好模型。主要有两种方法,一种是将药物敏感的肿瘤细胞维持培养于含化疗药物的培养基中诱导其产生耐药性,另一种是将敏感肿瘤细胞间歇短期暴露于较高浓度抗肿瘤药物中诱导敏感肿瘤细胞耐药,后者较好地模拟了临床病人体内反复间歇运用抗肿瘤药物的过程。人低分化胃腺癌细胞株BGC823由我国胃腺癌患者胃大弯处切除的组织经处理后建株,但针对5-FU的BGC823耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究均未见报道。我们应用反复大剂量冲击法结合逐步递增5-FU药物浓度法建立耐药细胞株BGC823/5-FU,该耐药细胞株较其亲代细胞BGC823对5-FU的耐药性分别提高10.82,同时它还对阿霉素、丝裂霉素和顺铂的耐药性分别提高2.50、22.23和2.00倍。我们检测了耐药细胞株P-糖蛋白和凋亡相关蛋白的表达。P-糖蛋白是多药耐药基因1(MDR1)表达产物,为一种分子量为170kD的跨膜糖蛋白,它能通过水解ATP获得能量,主动将药物从细胞内泵出细胞外,从而使细胞内药物浓度下降,药物抗肿瘤效应因此减弱甚至消失,表现出对药物的耐受现象。柔红霉素(daunorubicin,DNR)具有结合P-gp并被其外排的特性,因此,可根据此特性测定细胞内DNR的含量来间接反映P-gp的功能。本研究显示,与BGC823细胞比较,BGC823/5-FU细胞P-gp的表达有显著上升,而BGC823/5-FU细胞积累DNR的能力下降。表明P-gp及其介导的细胞内药物外排参与BGC823/5-FU细胞多药耐药的机制。目前认为凋亡受抑在肿瘤细胞的耐药中发挥着重要的作用。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中的抗凋亡和前凋亡蛋白,它们主要在内源性凋亡途径的调节方面发挥作用。Bcl-2通过线粒体途径参与凋亡调控,且Bcl-2/Bax比值决定了细胞对凋亡因子的敏感性。bcl-2基因表达下调可以导致肿瘤细胞凋亡,bcl-2基因高表达可抑制肿瘤细胞凋亡,降低对药物的敏感性。Caspase-3是凋亡级联通路和化疗药物诱导凋亡的关键蛋白,Bcl-2和Bax最终通过诱导caspase家族的释放导致细胞凋亡。本研究显示BGC823/5-FU细胞较BGC823细胞Bcl-2表达升高,Bax和caspase-3表达下降,这表明抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax和凋亡标志蛋白caspase-3与BGC823/5-FU细胞多药耐药性的产生有关。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中结构独特的新成员,是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子,主要表达于人未分化成熟组织以及多种肿瘤细胞中。近年来研究发现Survivin主要是通过caspase的活性来参与细胞凋亡的抑制,Survivin还可协同Bcl-2发挥抗凋亡效应。有研究表明胃癌组织SurvivinmRNA的表达明显高于正常胃组织,胃癌淋巴结转移患者的Survivin的表达明显高于未转移者,这提示Survivin与胃癌发生发展密切相关,而Survivin在胃癌多药耐药细胞BGC823/5-FU中的作用尚未见报道。本研究发现,与BGC823细胞