应用rapd技术构建与抗性相关的抗根结线虫病基因连锁的scar标记

应用rapd技术构建与抗性相关的抗根结线虫病基因连锁的scar标记

根结线虫是番茄的一个重要疾病之一。随着非点源植物面积的增加，尤其是日光温室的大面积推广，根结线虫的危害日益严重。目前，生产根结线虫的栽培方法很多，但抗病性效果并不理想，不能从根本上解决问题。抗病品种的创造是经济有效的方法。番茄抗根结线虫育种研究始于19世纪30年代,1940年Bailey筛选出11份抗根结线虫的材料,1956年Gibert指出对根结线虫的抗性基因是由一个显性基因Mi控制。以后人们又相继研究了Mi基因,并发现Mi基因是所有番茄栽培种的惟一抗原。该基因可抗除北方根结线虫以外的其余3种主要线虫。目前克隆Mi基因技术亦趋成熟,Messeguer等(1991)构建了Mi基因侧翼的9个高分辨率RFLP图谱。Aarts(1991)研究出与Mi紧密连锁的酸性磷酸酶-1(APS-1)座位的一个探针。Kaloshian等和Milligan等用定位克隆的方法从野生番茄(Lycoperisiconperuvianum)中分离到Mi基因。另外,随着转基因研究的进展,可利用转入人工抗线虫基因使番茄获得对根结线虫抗性成为可能。目前,在植物抗病育种中,分子标记技术的发展为育种工作提供了有力的辅助工具,利用紧密连锁的分子标记可以在任意发育阶段对品种的抗性进行鉴定。RAPD标记是目前最常用的分子标记之一,但其可靠性、稳定性较差。根据RAPD标记两端序列,设计18～25碱基的引物,通过PCR特异扩增,可以将RAPD标记转化为SCAR(Sequencecharacterizedamplifiedregion)标记,SCAR标记特异性和重复性较好,操作简单、快捷,在分子标记辅助育种中具有重要的应用价值。本研究应用随机扩增多态性DNA(RandomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术,筛选到一个与番茄抗根结线虫病基因连锁的RAPD标记,并将该标记成功地转化成了SCAR标记,为应用分子标记辅助育种及为进一步克隆该抗病基因打下基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1波斯材料抗病亲本04957、感病亲本T431以及04957和T431有性杂交的F2代单株。上述材料均由东北农业大学园艺系番茄课题组提供。1.1.2病毒病原线虫为南方根结线虫(Meloi-dogyneincognita),由本课题组提供。1.2方法1.2.1抗感亲染对fpss2代群体的致病性调查用水培繁殖方法大量繁殖虫态一致的二龄幼虫,接种于抗感亲本及F2代群体各单株,到接种后50d,调查发病情况,将F2代群体分为抗病和感病两级。具体方法参照文献进行。1.2.2羽毛dns的提取所有试材播种于温室,待幼苗长出2～3片真叶时,取新叶约100mg,采用改良的SDS法提取DNA。1.2.3dntps和taqcda聚合酶系统集成的构建随机引物筛选采用Michelmore的混合分组分析法(BSA)进行。扩增反应体系为20μL。反应液组成为10×PCRbuffer、2.5mmol/L的dNTPs、25mmol/L的MgCl2、1U的TaqDNA聚合酶、15ng/μL随机引物,20～50ng模板DNA。反应程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,36℃复性1min,72℃延伸1.5min,35个循环;最后72℃延伸10min。反应在美国PE公司生产的PE-480型扩增仪上进行,扩增产物在1.4%的琼脂糖凝胶上电泳分离,溴化乙锭染色后,在紫外凝胶成像系统中观察并拍照。1.2.4菌株鉴定及测序利用DNA快速回收试剂盒,从1.0%琼脂糖凝胶中回收RAPD特异片段,纯化后用pGEM-T-Easy载体连接,转化于大肠杆菌(E.coli)DH5-α菌株上。测序由上海生工公司完成。根据测序结果,利用DNAMEN软件设计出1对SCAR标记的特异引物,除将RAPD扩增条件调整为上下游引物各1μL、59℃复性外,其它同RAPD分析,用该引物对亲本及F2分离群体进行扩增验证。2结果与分析2.1番茄抗根结线虫病鉴定结果在感病亲本T431充分发病的情况下,参照抗病亲本04957的抗性表现对F2代群体的183个单株进行了番茄抗根结线虫病鉴定,其中抗病138株,感病45株,χ2测验符合单显性基因的遗传规律。2.2opd20/400对mi基因型别的复选筛选Operon公司的8组共160条随机引物,对抗感亲本进行RAPD分析,经3次重复,有18条引物能够在抗感亲本间扩增出多态性条带,然后将这18条多态性引物到抗感池进行复选以及进行F2代单株验证,经3次重复,结果一致,得到1个特异引物OPD20,特异片段的分子量约为1500bp,将其命名OPD20/1500,可以初步确定OPD20/1500与Mi基因存在连锁关系(图1),用Mapmarker/3.0软件对分离群体单株的抗病性和分子标记的分离数据进行连锁分析,利用Kosambi函数将重组率转化成遗传图距[cM(centimorgan)],计算出OPD20/1500与抗病基因的连锁距离为9.0cM(表1)。2.3pd20/400p的建立将该RAPD特异片段回收、克隆后,经酶切鉴定,证明重组克隆所含的插入片段为所要的目的片段。在上海生工测序后得到该片段的全长序列。结果表明:该片段OPD20/1500的实际大小为1454bp,并且将此序列提交到GenBank,登录号为DQ090954。将获得的该RAPD片段的全长序列与其它基因序列进行同源性比对,发现与已知的抗病基因(Mi)没有同源性,而该序列中的部分碱基序列与水稻的微卫星片段MRG6300的一段核苷酸序列有一定的同源性,同源性高达96%,用Generunner软件初步分析其编码的氨基酸结构,发现没有完整的氨基酸序列,与番茄抗根结线虫病基因Mi没有联系。2.4rapd反应程序的优化及验证根据RAPD标记特异片段两端的碱基序列和引物设计原则,利用DNAMEN软件设计出了1对22和25个碱基的核苷酸引物。SenseprimerP1:5′-GGGTCGCTATGATAAGGATTCT-3′;Antisen-seprimerP2:5′-ACCCGGTCACCTTATTAATTAAATA-3′。为了确定这对引物的特异性,对供试植株进行了PCR扩增,因此,本试验中共设计了6个退火温度梯度,来达到优化反应程序的目的。最终确定59℃为反应的最佳退火温度,可以实现稳定扩增,反应的其它条件没有改变。用设计的引物P1+P2在优化好的59℃退火温度下对抗感亲本、抗感池及其F2代抗感单株进行PCR扩增。结果表明,在抗病亲本、抗病池及F2代抗病单株中均能稳定扩增出1条大小为1000bp左右的特异片段,而在感病亲本、感病池及F2代感病单株中均无此差异片段的扩增。分析结果和RAPD分析完全一致,而且稳定性和重复性大大提高,此结果表明RAPD标记OPD20/1454已被成功地转化成SCAR标记,暂将该SCAR标记命名为SCD20/1000。图2为获得的SCAR标记在抗感亲本、抗感池及F2代单株中扩增情况验证。3抗感基因池的构建番茄抗根结线虫基因Mi,可抗除北方根结线虫以外的其余3种主要根结线虫,Mi基因是所有番茄栽培种的惟一抗原。而本研究中所用抗病亲本材料04957经验证对南方根结线虫表现高抗,含有Mi基因。目前侵染番茄的大多是南方根结线虫,所以在进行抗病性鉴定接种时也用南方根结线虫作为接种源。本研究中所建立的分子标记在理论上除可以验证对南方根结线虫的抗性外,还可以验证除北方根结线虫以外的其余2种主要根结线虫的抗性,这些在实践中有待于进一步验证。本研究通过运用RAPD技术,采用混合分组分析法(BSA),获得了1个与番茄抗根结线虫病基因连锁的RAPD标记OPD20/1500,利用BSA法需要构建抗感基因池,试验结果的可靠性依赖于抗病植株和感病植株的准确鉴定,本试验中抗病性鉴定方法参照Yu等的方法进行,本试验方法保证了抗病性鉴定结果的准确性。由于RAPD标记是用十个核苷酸的随机引物进行PCR扩增得到的,对反应条件的变化很敏感,因此重复性较差,但如果严格控制反应条件,采用同一公司同一批号的反应试剂,同样可以获得重复性较好的结果。而SCAR标记是另一种基于PCR技术的分子标记,它通过1对特异引物来扩增单个基因组序列,SCAR标记与RAPD相比,其对反应条件的敏感程度低,因此特异性和重复性较好,