基因芯片技术检测宫颈癌及癌前病变石蜡标本中人乳头瘤病毒感染的临床意义

基因芯片技术检测宫颈癌及癌前病变石蜡标本中人乳头瘤病毒感染的临床意义

宫颈是女性生命的第二倍。全世界每年都有30万颗肿瘤。我国宫颈癌的发生率和死亡率约占全世界的1/3。宫颈癌的发生、发展是由量变到质变、渐变到突变的过程,早期发现、早期诊断是降低宫颈癌死亡率的关键。现已证实,高危型HPV感染是宫颈癌的根本致病因素。本研究主要应用基因芯片技术,检测宫颈癌及宫颈癌前病变石蜡标本中23种常见的HPV亚型,并探讨其应用于临床的价值和意义。1材料和方法1.1患者性别、年龄及基因芯片检测收集2002年5月-2007年2月解放军总医院妇科门诊及住院患者的153例宫颈病变石蜡包埋标本,其中宫颈炎12例,宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ24例,CINⅡ/Ⅲ40例,宫颈癌77例(鳞癌51例、腺癌26例)。宫颈癌标本取材前未行放疗及化疗,年龄24~75岁,平均43.4岁。宫颈癌患者病理分级为G1-G2级者45例,G3级32例。按2003年FIGO临床分期标准,Ⅰa-Ⅱa期50例,Ⅱb期24例,Ⅲ期3例。阳性对照2例(北京中杉金桥生物技术有限公司提供HPV6型和HPV16型样本各1例);阴性对照2例(蒸馏水为杂交液)。基因芯片检测试剂盒为深圳亚能生物技术有限公司产品,包括5种低危HPV亚型:6、11、42、43、44;18种高危亚型:16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4。每张实验用膜条在阳性对照位点处均应有蓝色斑点出现,此时判读结果视为有效。1.2pcr扩增石蜡组织5μm切片放入EP管中,二甲苯石蜡、乙醇脱二甲苯后室温干燥。加入裂解液60μl充分震荡混匀,沸水加热10min。10000r/min离心10min后,取上清5μl加入试剂盒中含通用引物的PCR混合液中,反应总体积25μl进行PCR循环。循环温度设置:50℃15min;95℃10min;94℃30s,42℃90s,72℃30s,40个循环后72℃延伸5min。将标记好的基因芯片膜条及扩增的PCR产物放入6mlA液[2×SSC,0.1%十二烷基磺酸钠(SDS),pH7.4]中,沸水浴10min,使DNA变性。51℃杂交1h;杂交后的基因芯片放入40mlB液(0.5×SSC,0.1%SDS,pH7.4)中,51℃洗涤15min,再用POD(1∶2000)溶液室温轻轻振摇30min,A液和C液(0.1mol/L柠檬酸钠,pH5.4)摇洗,然后放入新配置的显色液(0.1mol/L柠檬酸钠,3%四甲基联苯胺,pH5.4)中显色,10~30min后肉眼观察结果。1.3统计方法采用SPSS10.0软件,比例数的比较采用χ2检验。2结果2.1高危型hpv感染率本实验HPV基因芯片阳性内对照部位均出现蓝色斑点。阳性对照2例结果显示阳性,阴性对照2例结果显示阴性。高危型HPV感染率随着病理学级别的增高而上升。此外,在宫颈炎组织中低危型HPV感染率主要为HPV6、11亚型。感染率见表1。2.2高危亚型感染率本研究中,HPV16是主要的高危致病亚型,占88.98%;HPV18为第2位高危致病亚型,占33.06%;HPV52、33、59、68为少数感染的高危亚型。48例HPV感染的宫颈鳞癌中,HPV16亚型感染率为93.73%,在23例腺癌中,其感染率为82.61%,两者比较差异无统计学意义(χ2=1.10,P>0.05);在鳞癌中,HPV18感染率为27.08%,腺癌为52.17%,两者比较差异有统计学意义(χ2=4.29,P<0.05)。见表2。2.3hpv混合感染率在宫颈炎组织中,HPV均为单一感染。在CINⅠ中,HPV混合感染率为20.00%,CINⅡ/Ⅲ为28.57%,宫颈癌36.62%。HPV混合感染率随着病理学级别的增高而上升。见图1。3不同保护亚型pv感染的比较目前发现的HPV亚型已有100余种。按照与宫颈癌的关系,将其分为高危型和低危型。流行病学调查显示,高危型HPV导致宫颈癌的概率约为1.0%,而低危型仅为0.1%。现已明确高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的根本原因。统计结果表明,大多数CIN伴有HPV感染,>90.0%的宫颈癌都可以检测到HPVDNA。我国宫颈癌高发区筛查资料也显示,几乎所有宫颈癌患者HPV均为阳性。目前,HPV的主要检测方法是HPVDNA第二代杂交捕获试验(HCⅡ),其最大的缺点是不能进行分型,不利于流行病学和病因学的进一步深入研究。近年来,已采用基因芯片技术应用于HPV分型,结合了PCR扩增和原位杂交技术,其特点是高通量、敏感性高、特异性强,但多用于新鲜组织,石蜡标本较少。本研究在石蜡标本得出的结果显示,高危型HPV感染率随着病理学级别的增高而上升,这与Andersson等的报道基本相符。这不仅说明了HPV感染与宫颈癌的发生密切相关。同时,Tsuda等研究显示,>95.0%的宫颈癌是由高危型HPV感染引起的,其中HPV16是最常见的致病亚型。本实验显示,HPV16为主要高危致病亚型,HPV18为第二高危致病亚型,还有少数患者感染HPV52、33、59、68高危亚型。低危型HPV在宫颈癌中尚未检测出来。但在宫颈炎和CINⅠ中检测出来,主要为HPV6、11亚型,由此证实宫颈癌主要由高危型HPV感染所引起。Bulk等报道,HPV16与宫颈鳞癌和腺癌的发生密切相关,而HPV18与腺癌的关系更为密切。本研究结果显示,鳞癌和腺癌的HPV16亚型感染率分别为93.73%、82.61%,鳞癌比腺癌高,两者比较差异无统计学意义;鳞癌和腺癌的HPV18感染率分别为27.08%、52.17%,两者比较差异有统计学意义,提示HPV18与腺癌的关系比与鳞癌更密切。通常HPV将在感染后的6~12个月内自行消失,1年后HPV持续感染率为30%,2年后渐下降,仅为9%。只有HPV持续感染,才是激发宫颈上皮恶性转化的最重要危险因素,HPV持续感染能使宫颈癌的发生风险提高250倍。Ho等学者认为,HPV多重感染的患者出现持续感染的危险性更大。本组中,宫颈炎组织中HPV均为单一感染,CINⅠ的混合感染率为13.33%,CINⅡ/Ⅲ为25.72%,宫颈癌为33.80%。HPV混合感染率随着病理学级别的增高而增高。不同地区和不同种族人群对HPV各个亚型的易感性不同,而不同HPV亚型对不同种族人群