sz诱导大鼠糖尿病模型的研究

sz诱导大鼠糖尿病模型的研究

糖尿病是中医学的三大疑难疾病之一，发病率在全球范围内呈逐渐上升趋势。目前,糖尿病及其并发症的病因、发病机理尚未完全阐明,其预防和治疗措施仍不完善,因此,建立较理想的动物模型来研究该病的发病机制、预防和治疗具有重要意义。自1960年开始利用链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱发动物糖尿病模型以来,STZ已成为目前广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂。有研究指出大鼠尾静脉注射STZ成模率可达90%,因腹腔注射较尾静脉注射容易、准确快速,现多采用腹腔注射法。判断造模成功的指标,研究中多采用测外周血糖、尿糖、血清胰岛素水平、C肽值等。国外有学者采用口服葡萄糖耐量试验(oralglucosetolerancetest,OGTT)作为判断与比较糖尿病情况的指标之一,有学者在用STZ诱发大鼠糖尿病模型的研究中,但也只用空腹血糖值作为判断大鼠成模的指标,较少使用OGTT。笔者在研究过程中发现,单用空腹血糖值无法反映出大鼠造模的真实情况,因此,本试验在观察大鼠品系、给药剂量、给药次数对大鼠成模影响的同时,研究与空腹血糖相比,OGTT对判断大鼠糖尿病成模的意义。1材料和方法1.1实验动物中心清洁级Wistar雄性大鼠24只,清洁级SD雄性大鼠60只,体重170g~200g,购于广州中医药大学实验动物中心,饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室。标准化饲养房笼子喂养,饲以标准颗粒饲料,自由饮水。饲养环境温度为18℃~22℃,室内湿度保持在50%~70%,每天日照时间为8:00~20:00。试验前测定每只大鼠的血糖值范围在3.0mol/L~5.0mmol/L之间,为正常血糖值,可以进行造模试验。1.2stz分散菌种的制备STZ(Sigma公司,S0130),将STZ粉末溶于pH4.5的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液,新鲜配制成10g/LSTZ溶液,用0.2μm微菌滤菌器过滤除菌;美国强生稳豪微量血糖测定仪(配套血糖试纸)。1.3方法1.3.1单次给药后sd大鼠成模率测定动物适应性饲养1周,饮食正常、体重不减轻,且尾尖采血测定血糖值正常的大鼠可用于试验。注射STZ前1d禁食不禁水24h。根据不同试验目的分为3个试验,同时进行。随机取16只SD大鼠作为6个试验组的正常对照组,腹腔注射1mL柠檬酸钠缓冲液。试验一采用24只Wistar鼠随机分为中剂量组(55mg/kg)和高剂量组(65mg/kg),每组12只,均一次性腹腔注射。试验二采用12只SD鼠一次性腹腔注射STZ55mg/kg,与试验一注射剂量为55mg/kg的Wistar鼠作比较。试验三采用32只SD大鼠分为一次给药组和两次给药组。一次给药组一次性腹腔注射STZ55mg/kg,两次给药组第1次腹腔注射STZ55mg/kg,第8天行第2次腹腔注射同等剂量STZ,观察期间进行OGTT,并对比按空腹血糖值和OGTT结果分别计算出的大鼠成模率。以上试验均在注射STZ5d后大鼠尾尖采血测空腹血糖值,观察8周,计算成模率和死亡率。1.3.2微量血糖测定①观察大鼠饮水量和一般状态,每周测量体重;②空腹血糖测定:大鼠禁食8h后尾尖采血,用微量血糖测定仪测血糖。③口服葡萄糖耐量试验(OGTT):试验前一晚大鼠禁食,第2天测空腹血糖后,每只大鼠灌服500g/L葡萄糖,2.5g/kg,测灌服葡萄糖后0.5、1、2、3h的血糖值。1.3.3成功评价模型的标准注射STZ5d后动物空腹血糖值>16.7mmol/L,或OGTT异常者,判定为1型糖尿病动物模型,并结合胰腺组织病理切片。1.3.4病理样品的采集和处理试验结束后将大鼠处死,剖腹,观察胰、肝、肾等脏器是否有病变,用100mL/L福尔马林固定液固定、脱水,石蜡包埋,HE染色。1.4统计方法采用SPSS11.0软件进行统计分析。组间比较采用t检验,方差不齐时用F检验。2结果2.1高剂量组65g/l的成模率和死亡率Wistar鼠中剂量组(55mg/kg)的成模率和死亡率均为66.7%,高剂量组(65mg/kg)的成模率和死亡率均为100%(表1)。2.2空腹血糖造模成功标准比较Wistar鼠和SD鼠在给药一次,剂量为55mg/kg的条件下,以空腹血糖>16.7mmol/L为造模成功的标准。两个品系的大鼠其成模率分别为83.3%和33.3%,死亡率分别为83.3%和0(表2)。2.3不同的给药次数对stz对大鼠糖尿病模型的影响SD大鼠一次给药的成模率为31.25%,死亡率为0,两次给药的成模率为50%,死亡率为0(表3)。2.4人胰腺病理检测在模型组中,随机同时检测空腹血糖和OGTT。结果发现,空腹血糖值与OGTT的异常阳性率分别为50%和75%,胰腺病理检测发现,OGTT异常的大鼠均有明显病理改变,即胰岛变小,密度减低,胰岛分布稀疏,胰岛细胞数量减少、肿胀,胞质着色浅,细胞核固缩。结果见表4和图1B,图1D。2.5大鼠体内压力随着病程进展,模型组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、毛失去光泽、脱毛、消瘦、活动减少和伤口易感染等表现。观察8周,模型组大鼠体重减轻20%,饮水量增加近180%。2个月后1只出现烂尾和糖尿病足,1只出现嘴角溃疡。2.6胰岛细胞团型将大鼠处死,取胰腺组织做病理检测。胰腺病理检测普通HE染色显示,正常对照组胰岛为圆形、卵圆形细胞团,界限清、无包膜,细胞团块大小不一,胰岛细胞数量较多,胞质丰富,核圆形,胰岛分布广(图1A,图1C);糖尿病模型组胰腺常规HE染色中胰岛变小,密度减低,胰岛分布稀疏,胰岛细胞数量减少、肿胀,胞质着色浅,细胞核固缩(图1B,图1D)。3大鼠stz后感染情况的变化STZ是一种广谱抗生素,具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用,对动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用,现已广泛应用STZ制备糖尿病动物模型。有文献指出采取两步给药法,STZ剂量为10mg/kg,隔1d给予50mg/kg,其成模率高,死亡率低,成模稳定。本试验亦采用两次给药法,其成模率高于一次给药组,死亡率为0,到试验结束维持时间达3个月。STZ成模率不及一些文献报道的可达80%~90%,其原因可能是注射的剂量不同,实验大鼠间个体差异较大,也可能与地域差别及腹腔注射范围大,注射药物易误入皮下或腹腔脏器等有关。可通过加大STZ的注射剂量或尾静脉注射等方法来提高成模率,但随着剂量的增加,死亡率会有增加的趋势。HainanC等报道造模未成功的大鼠,与一种抗氧化蛋白——金属硫蛋白Metallothionein(MT)作用有关,MT可在一些细胞中保护DNA免受化学损伤,推测是由于MT的过表达能够保护β细胞的DNA免受损伤,从而阻止了STZ导致糖尿病。因STZ具有毒性和副作用,会导致大鼠死亡。试验一高剂量组Wistar大鼠注射STZ后7d内死亡率达100%,2个月仍存活的4只均属中剂量组。试验三中SD大鼠一次给药组和两次给药组注射STZ后均无死亡。其一与注射剂量有关,剂量大于大鼠可耐受程度,毒性或副作用导致大鼠死亡。其二可能与大鼠品系和体质有关。Wistar大鼠给药后成模率与死亡率均高于SD大鼠,推断Wistar大鼠对STZ敏感性高于SD大鼠,但其抵抗力低于SD大鼠。此仅为试验结果的初步推断,有研究亦提出造模时SD鼠可能优于Wistar鼠。目前,很多研究使用Wistar鼠作为造糖尿病动物模型的实验对象,本试验与以往研究有差异,可能是例数不多或为偶发事件,需重复再研究。给药后的1周内应加强大鼠的饲养,勤换垫料,防止感染,尽量减少大鼠死亡。因试验条件原因,本试验没有比较不同剂量对SD大鼠造模情况的影响。OGTT是在当血糖升高的程度未达到糖尿病诊断标准,不能确诊糖尿病而进行的一种进一步确诊糖尿病的检验措施。通过OGTT可以了解和观察糖代谢功能是否健全,对隐匿型糖尿病的诊断有重要意义。可能因OGTT较花费时间,动物数量多时需耗较多人力物力,故试验中较少应用。比较空腹血糖值和OGTT异常阳性率发现,动物试验中空腹血糖值并不能很准确地反映出动物成模的真实情况,有的大鼠其空腹血糖值